【摘 要】
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,广泛存在于动植物和微生物。GABA具有改善脑机能提高记忆力、改善视力、利肝保肾、降血压等功效。本文以实验室筛选获得的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）TCCC 13007为菌株,利用液质联用（high performance liquid chromatography-mass spe
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,广泛存在于动植物和微生物。GABA具有改善脑机能提高记忆力、改善视力、利肝保肾、降血压等功效。本文以实验室筛选获得的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）TCCC 13007为菌株,利用液质联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）分析了烟酸提高短乳杆菌发酵GABA产量的机理,通过单因素缺失实验和响应面实验确定了最佳的化学限定培养基（chemically defined media,CDM）,优化了全细胞转化的发酵培养基,通过气质联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）分析了精氨酸提高全细胞转化效率的机理。1.通过LC-MS分析烟酸提高GABA产量的代谢机理,得到33种差异性代谢物,添加烟酸的实验组中不饱和脂肪酸含量均显著高于对照组,而饱和脂肪酸含量显著降低,暗示实验组细胞膜通透性增加。通过碘化丙啶（PI）染色实验,证明了烟酸能够提高短乳杆菌细胞膜的通透性。2.通过对28种化合物进行单因素缺失实验,其中有9种为菌体生长必需的化合物,6种对菌体生长有促进作用的化合物。利用Plackett-Burman筛选出对菌体生长影响最大的3种因素:精氨酸、丝氨酸和D-生物素。用最陡爬坡实验得到最适添加量为精氨酸1.6 g/L、丝氨酸0.6 g/L和D-生物素0.05 g/L。通过Box-Behnken响应面实验证明3种因素具有交互作用,得到最优的浓度:精氨酸1.68g/L、丝氨酸0.52 g/L和D-生物素0.04 g/L。对优化的CDM验证,菌体培养13h后OD600达到1.153,比初始CDM提高了13.4倍。3.对精氨酸、葡萄糖、酵母浸粉、谷氨酸钠和D-生物素进行单因素试验并且通过正交实验,得到最优的全细胞转化的发酵培养基:葡萄糖15 g/L、酵母浸粉15 g/L、精氨酸0.5 g/L、D-生物素0.06 g/L。通过最优发酵培养基发酵24 h,OD600为9.87,然后进行全细胞转化生成GABA,转化产量为103.67 g/L,GABA的摩尔转化率为95.6%。4.利用GC-MS分析精氨酸提高短乳杆菌转化效率的代谢机理,得到14种差异代谢物。添加精氨酸的实验组中,假尿嘧啶核苷、赖氨酸、鸟氨酸和6-磷酸葡萄糖的显著高于对照组,证明精氨酸通过精氨酸脱亚胺酶途径迅速产生大量ATP,促进短乳杆菌生长和谷氨酸脱羧酶的表达。
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