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目的:制备p21WAF1/CIP1基因表达缺失的人结肠癌HCT-116细胞系,比较HCT-116细胞及p21缺失的HCT-116-p21-/-细胞对化疗药物敏感性的差异,比较HCT-116和HCT-116-p21-/-细胞中p21泛素化表达的不同,初步探讨P21泛素化对人结肠癌细胞HCT-116化疗敏感性的影响方法:1.采用siRNA技术沉默HCT-116细胞中p21基因表达,构建HCT-116-p21-/-细胞,提取HCT-116-p21-/-细胞的总RNA,采用RT-PCR技术对siRNA靶区片段进行扩增,并对靶区行基因测序,分析可能存在的单核苷酸多态性(SNP)位点,避免因SNP导致siRNA作用失活。2.采用MTT法检测化疗药物5氟尿嘧啶(5-Fu)、奥沙利铂(L-OHP)及伊立替康(CPT-11)对人结肠癌细胞HCT-116与HCT-116-p21-/-增殖抑制的影响。3.采用流式细胞术(Annexin V/PI双染法)检测化疗药物5氟尿嘧啶(5-Fu)、奥沙利铂(L-OHP)及伊立替康(CPT-11)对人结肠癌细胞HCT-116与HCT-116-p21-/-凋亡的影响。4.采用蛋白印迹法Western Blot检测经化疗药物5氟尿嘧啶(5-Fu)、奥沙利铂(L-OHP)及伊立替康(CPT-11)对人结肠癌细胞HCT-116与HCT-116-p21-/-细胞中MDM2、p53及泛素Ub表达的影响。结果:1.对HCT-116细胞siRNA靶区基因片段进行测序,并对结果进行BLAST序列对比,未发现常见的SNP位点,经Western Blot检测HCT-116-p21-/-细胞的P21蛋白表达基本消失,证明实验采用的siRNA技术沉默了HCT-116细胞中p21基因表达。2.MTT法检化疗药物对HCT-116细胞的抑制率为:0.73±0.27(空白对照)、0.34±0.19(5-Fu)、0.12±0.15(L-OHP)、0.23±0.16(CPT-11);对HCT-116-p21-/-细胞的抑制率为:0.92±0.25(空白对照)、0.56±0.26(5-Fu)、0.35±0.11(L-OHP)、0.45±0.03(CPT-11);经配对t检验,两组细胞抑制率有统计学差异,p<0.001,化疗药物对HCT-116细胞的抑制作用更明显。3.Annexin V/PI双染法检测化疗药物对HCT-116细胞的凋亡率为:0.086±0.027(空白对照)、0.562±0.082(5-Fu)、0.372±0.075(L-OHP)、0.457±0.023(CPT-11);对HCT-116-p21-/-细胞的凋亡率为:0.069±0.024(空白对照)、0.305±0.031(5-Fu)、0.377±0.083(L-OHP)、0.266±0.073(CPT-11);经配对t检验,两组细胞凋亡率有统计学差异,p<0.001,化疗药物对HCT-116细胞的凋亡作用更明显。4.Western Blot实验检测HCT-116-p21-/-及HCT-116细胞中蛋白的表达。未加入化疗药物:HCT-116-p21-/-细胞中的P53蛋白表达水平增高,与HCT-116细胞比较结果具有统计学差异,p<0.05;HCT-116-p21-/-细胞中的MDM2蛋白表达水平下降,与HCT-116细胞比较结果具有统计学差异,p<0.05;泛素Ub蛋白表达水平两者无统计学差异。加入化疗药物作用后,HCT-116-p21-/-及HCT-116细胞与各自对照组相比较:P53蛋白表达水平呈上调趋势,与对照组(未加化疗药物)相比,有统计学差异;而5-Fu作用后两组细胞的MDM2蛋白表达水平呈上升趋势,而CPT-11作用后两组细胞的MDM2蛋白表达水平呈下降趋势,差异有统计学意义;L-OHP作用后HCT-116细胞的MDM2蛋白表达水平呈上升趋势,HCT-116-p21-/-细胞的MDM2蛋白表达水平呈下降趋势。泛素Ub蛋白表达水平无统计学差异。结论:1.p21缺失的人结肠癌细胞对化疗药物更不敏感,而p21的表达可增强人结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。2.在人结肠癌细胞中,p53信号通路的激活是化疗药物的主要作用机制,而p21的表达可增强化疗药物对p53信号通路的活化作用。3.p21的泛素化作用依赖于MDM2蛋白,p21泛素化也是调节结肠癌细胞化疗敏感性的重要作用机制之一,泛素蛋白ub在p21泛素化过程中的作用仍有待进一步明确。