论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种老年人常见的神经系统变性疾病，病理上主要表现为黑质多巴胺(DA)能神经元的丢失死亡及路易小体形成。临床上主要表现为肌强直、震颤、运动迟缓及姿势步态障碍。目前对PD主要以左旋多巴等药物治疗为主，然而长期用药会出现疗效减退、异动症甚至是左旋多巴衰竭综合征等棘手的临床问题，至今还无法得到满意的解决。因此目前迫切需要寻找和研发新型的抗PD药物，以替代和弥补已有药物的缺陷和不足。垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是近年来发现的一种具有多种生物活性的神经肽，大量研究表明，在离体和在体水平，PACAP可有效拮抗外源性毒素作用，逆转神经元的死亡，对于多种神经损伤具有潜在的治疗作用。然而目前对于PACAP是否可以有效拮抗PD相关神经毒素一鱼藤酮以及直接外周静脉给药是否可对PD模型发挥治疗及保护作用尚未见报道。本研究拟采用鱼藤酮诱导的PC12细胞模型以及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6．四氢吡啶(MPTP)诱导的PD小鼠模型观察PACAP27可能的保护和治疗作用及其分子机制。
本课题共分为四个部分：
第一部分：PACAP27抑制鱼藤酮诱导PCI2细胞凋亡及其胞内信号转导通路的研究以鱼藤酮损伤的PCI2细胞作为离体PD模型，采用MTT法检测细胞活性；流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位及活性氧(ROS)变化；Apo-oNE均质荧光法检测0Caspase-3活性变化，对PACAP27是否抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡及其胞内分子机制进行研究。研究发现，经鱼藤酮处理24小时后PCI2细胞活性呈剂量依赖性下降(P<0.01)；PACAP27(10<’-12＞>～10<’-7>mol/L)对鱼藤酮诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用，而PACAl受体拮抗剂PACAP6-27可逆转这一效应。PKA激活剂db-cAMP(10<’-4>mol/L)，Forskolin(10<’-6>mol/L)可模拟PACAP27的保护作用，而PKC激活剂TPA(10<’-7>mol/L)则无此作用，PKA抑制剂H-89(10<’-6> mol/L)可明显削弱PACAP27的保护作用，而PKC抑制剂Myr-ψPKC(10<’-6>mol/L)则无此作用；ERK抑制剂PD98059(2×10<’-5> mol/L)及P38抑制剂SB203580(5x10<’-5>mol/L)可显著削弱PACAP的保护作用，而JNK抑制剂SP600125(4x10<-5>mol／L)则无此作用；鱼藤酮可明显活化Caspase-3，而PACAP27则能抑制其活化；鱼藤酮可降低线粒体膜电位，而PACAP27无法逆转其诱导的线粒体膜电位减低；ROS并不随鱼藤酮浓度(50-500nmol／L)的增高而升高，在鱼藤酮的浓度达到1000nmol／L时ROS才出现明显增高(P<0.05)。上述结果提示PACAP27通过PACl受体介导，激活了PKA和MAPK信号通路，对鱼藤酮诱导的细胞凋亡进行了有效抑制，同时鱼藤酮诱导的这种细胞凋亡可能主要与非线粒体依赖的Caspase-3的活化有关。ROS对于鱼藤酮诱导的细胞凋亡并非必需因素，其胞内水平可能取决于鱼藤酮的原发性抑制效应和继发性促进效应的共同作用。
第二部分：PACAP27及鱼藤酮对PCI2细胞膜电压依赖性钾通道及PACI受体的影响采用免疫荧光染色显示PCI2细胞膜表达有Kvl.2、Kvl.3、Kv2.1、Kv3.1b、Kv4.2及PACl受体；全细胞膜片钳证实了PCI2细胞可诱导出IK、IA电流；Real-time PCR及Western blot检测发现，鱼藤酮在mRNA水平，可引起Kvl.2、Kv2.1表达增高，但在蛋白质水平却几乎抑制了所有Kv；而PACAP在mRNA水平，对Kv无明显影响，同时也不能拮抗鱼藤酮引起的Kv增高(Kvl.2、Kv2.1)，但在蛋白质水平PACAP却可以作用于某些Kv(Kv3.1b、Kv4.2)拮抗鱼藤酮引起的表达降低；在mRNA水平，鱼藤酮可使PACl及PACAP表达增高，且在加入外源性PACAP作用后，内源性PACAP表达仍增高(P<0.05)。上述研究表明鱼藤酮可使Kvl.2、Kv2.1mRNA表达增高，随后可能通过调控转录后水平又抑制了Kv的表达，而PACAP27则可能也通过调控转录后水平增加了某些Kv蛋白(Kv3.1b、Kv4.2)的表达，从而拮抗鱼藤酮诱导的细胞凋亡及缺氧。在鱼藤酮作用下，PCI2细胞自身可通过增高PACl受体及内源性PACAP的表达部分代偿细胞的损伤。
第三部分：PACAP27对MPTP诱导PD小鼠模型治疗作用的研究
采用PACAP外周静脉直接给药对MPTP诱导PD小鼠模型可能的治疗及保护作用进行研究。免疫组化染色显示PACAP能拮抗MPTP引起的黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性神经元损失，PACAP治疗组(2ug／d，0.2ug/d，0.02ug／d)较NS治疗组TH阳性神经元明显增多，并且纹状体蛋白免疫印迹结果与上述免疫组化结果相一致。在MPTP作用下，囊泡转运体DAT和VMAT2的表达下降，然而采用PACAP干涉后却出现了多种趋势的变化：DAT在PACAP治疗组中，2μg/d组与NS治疗组比较明显升高，而0.2μg／d组和0.02μg/d组则较NS治疗组无明显变化；DAT在PACAP预处理组中，0.2μGd组较NS预处理组明显增高，而2μg/d组无明显变化，0.02μg/d组则降低。VMAT2在PACAP治疗组中，2μg／d组较NS治疗组明显升高，而O.21μg／d组无明显变化，0.02μg／d组则降低；VMAT2在PACAP预处理组中，0.2μ/d组较NS预处理组明显增高，而2μg／d组、0.02μg／d组无明显变化。采用HPLC-ECD对小鼠纹状体单胺类神经递质进行检测，发现DA及其代谢产DOPAC在MPTP小鼠出现了明显下降，PACAP治疗组(0.02μg／d)DOPAC含量较NS治疗组明显升高(P<0.05)，与正常对照无明显差异；其他治疗组则未见这种效应。上述研究表明，静脉注射PACAP27可以对MPTP诱导的PD小鼠模型产生明显的治疗作用，但PACAP预处理却无明显的保护作用；低浓度PACAP在减少DA能神经元死亡的同时，可能比高浓度PACAP更好地恢复了DA能神经元的功能，从而增加了DoPAC的含量；PACAP的治疗作用可能与DAT、VMAT2的表达高低无直接关系．
第四部分：PACAP27对MPTP诱导PD小鼠模型治疗作用机制的研究继续采用外周静脉注射的方式在MPTP小鼠PD模型上研究PACAP对与DA突触传递密切相关的ATP敏感性钾通道(KATP)、多巴胺受体(D1、D2)以及在突触间隙参与DA降解及外界毒素MPTP代谢的单胺氧化酶(MAO)和直接反映细胞状态的泛素蛋白酶体途径(UPP)的影响，对其发挥治疗作用的确切机制进行研究。间接免疫荧光染色显示PACl受体在黑质有较多分布；MPTP可引起KATP亚基Kir6.1、Kir6.2、Sur2b蛋白表达增高(P<0.05)，并且PACAP27治疗组随着PACAP浓度的增加，Kir6.1呈逐渐增加趋势，PACAP治疗组(0.02μg／d)明显高于NS治疗组的增高：然而预处理组却呈相反的变化状态；PACAP27治疗组随着PACAP浓度的增加，Kir6.2的增高呈逐渐减低趋势，PACAP治疗组(0.02μg／d)与NS治疗组的增高无明显差异；预处理组却呈现逐渐降低的变化趋势：PACAP治疗组Sur2b呈现与Kir6.1类似的变化，而Surl则变化不明显。采用[H<3>]标记的放射性配基结合实验，对MPTP小鼠模型纹状体D1、D2的受体密度(Bmax)改变进行研究，结果发现D1受体无明显改变，而D2受体则出现升高的趋势，在PACAP治疗组中，PACAP 治疗组(o.02μg／d)较正常对照组及NS治疗组受体密度增高；而PACAP预处理组也较正常对照明显增高，但与NS预处理组则无明显区别(p>O.05)；Western blot显示在MPTP小鼠黑质中，泛素蛋白(Ubiquitin，UB)的表达升高，而PACAP治疗组在高浓度时UB表达减少，但在低浓度时则不明显。对3种剂量的PACAP连续作用后的全脑进行了MAO活力检测，结果发现，小剂量PACAP(0.02μg/d)对MAO有抑制作用。上述结果表明PACAP27可能通过调控K<,ATP >D<,2>受体对MPTP诱导的小鼠模型进行了治疗作用，小剂量PACAP可能对MAO具有抑制作用。