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目的研究同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞株(MG-63和Saos-2)中VEGF和Survivin基因的抑制效应,和对细胞迁移,血管生成,增殖以及凋亡的影响。本研究通过探讨一链双靶siRNA的作用机制,拓展了目前的核酸干扰技术,为一链多靶核酸干扰技术的开发奠定了基础。本研究将为多靶siRNA核酸干扰相关药物的研发提供理论依据和技术支持。方法1.合成两个单靶siRNA(siRNA-Survivin和siRNA-VEGF),在此基础上,设计并合成同时靶向VEGF和Survivin基因的一链双靶siRNA(siRNA-VEGF-&Survivin)。2.将靶向VEGF和Survivin两个单靶siRNA和同时靶向VEGF和Survivin一链双靶siRNA转染到骨肉瘤细胞(MG-63和Saos-2)中,通过荧光显微镜检测转染效率。3.运用QRT-PCR和Western Blot技术检测各转染组细胞(MG-63和Saos-2)中VEGF和Survivin基因m RNA及蛋白的表达。4.免疫荧光法和免疫组化检测各转染组细胞(MG-63和Saos-2)中VEGF和Survivin蛋白的定位及表达,并检测其基因沉默效果。5.MTT法检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的增殖水平,流式细胞术检测MG-63和Saos-2细胞凋亡水平。6.划痕试验测定各转染组MG-63和Saos-2的细胞迁移,血管形成试验检测各转染组MG-63和Saos-2细胞的血管形成。结果1..成功构建符合设计要求的靶向VEGF和Survivin的单靶siRNA和一链双靶siRNA序列。2.各组siRNA均成功地转染到MG-63和Saos-2细胞中,转染率达到80%。3.Western Blot、QRT-PCR、免疫荧光和免疫组化法分析显示:单靶siRNA组和一链双靶siRNA组中VEGF和Survivin m RNA和蛋白的表达水平均低于对照组和未转染组,差异有统计学意义(均P<0.05)。一链双靶siRNA组在m RNA和蛋白的表达水平上与各单靶siRNA组相似,差异无统计学意义(P>0.05)。4.双靶siRNA组具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和血管形成,并阻抑肿瘤细胞迁移而促进肿瘤细胞凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。结论1.沉默VEGF和Survivin基因的单靶siRNA-VEGF、siRNA-Survivin和一链双靶siRNA均能有效下调MG-63和Saos-2细胞中VEGF和Survivin基因的表达。2.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA对骨肉瘤细胞(MG-63和Saos-2)的迁移和血管生成具有明显的抑制作用。3.体外实验证实,单靶siRNA和一链双靶siRNA均能抑制骨肉瘤细胞(MG-63和Saos-2)增殖,促进细胞凋亡。4.一链双靶siRNA能显著抑制骨肉瘤细胞(MG-63和Saos-2)的增殖和血管形成,并阻抑骨肉瘤细胞(MG-63和Saos-2)迁移而促进其凋亡,效果均明显优于单靶siRNA组。5.VEGF和Survivin基因无相关性,一链双靶siRNA较单靶siRNA发挥了双倍的抑制骨肉瘤细胞增殖和促进凋亡的效果。