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目的:胃癌是临床常见的恶性肿瘤,采用手术、放疗、化疗等传统治疗手段预后仍较差。近年来,DC 因其强大的抗原提呈及免疫激发能力引起人们广泛重视。胃癌细胞缺乏特异性肿瘤抗原且抗原性弱,以往的研究手段如癌细胞冻融、超声粉碎、癌细胞表面抗原酸洗脱等所能获取的肿瘤抗原量及刺激 DC 激发后续抗肿瘤免疫应答的能力均较弱。为实现肿瘤抗原对 DC 的更有效刺激,提高 DC 抗原提呈及免疫激发能力,实现更有效的肿瘤生物治疗效应,本实验采用细胞融合技术,将 DC 与胃癌细胞进行融合,希望能上调其表面分子并且实现稳定的表达,以加强其激活杀伤性 T 淋巴细胞活性的能力,实现强而有效的抗肿瘤免疫应答。在本实验中我们将对融合疫苗生物学特性及其抗胃癌免疫作用进行观察,对融合疫苗 B7-1、B7-2 协同刺激分子基因表达变化进行检测,并初步探讨其发挥作用的可能机制,希望能为胃癌 DC 瘤苗免疫治疗提供新的思路和理论基础。方法:第一部分:胃癌-树突状细胞融合疫苗制备。从胃癌患者外周血获取单个核细胞,采用贴壁培养方法,利用 GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导分化,获取成熟 DC,将其与 SGC7901 细胞经 PEG 诱导融合、HAT、HT 选择培养,获得纯净融合细胞。第二部分:胃癌-树突状细胞融合疫苗生物学特性观察。光镜、电镜观察融合细胞形态学改变,描记细胞生长曲线,观察融合细胞体外培养时克隆形成能力,混合淋巴细胞反应观察融合细胞激活 T 淋巴细胞的增殖能力,流式细胞术对融合细胞表面分子 CD1a、CD80、CD83、HLA-DR 表达进行检测,融合细胞裸鼠皮下注射,观察成瘤活性。第三部分:胃癌-树突状细胞融合疫苗抗胃癌作用观察。MTT 比色法检测融合疫苗体外杀伤胃癌细胞的细胞毒作用,流式细胞术检测融合疫苗对胃癌细胞周期的影响;观察融合疫苗对胃癌裸鼠种植瘤模型肿瘤生长的影响,流式细胞术 AnnexinV/PI双标法检测瘤细胞凋亡,流式细胞术检测肿瘤细胞周期改变,观察融合疫苗对肿瘤组织病理学改变的影响。第四部分:融合疫苗抗胃癌作用机理初步探讨。利用 RT-PCR法检测融合疫苗共刺激分子 B7-1、B7-2 mRNA 表达变化,初步探讨其增强抗胃癌免疫效应的可能分子机制。 6<WP=11>第三军医大学博士学位论文结果:1、胃癌患者外周血单个核细胞体外定向诱导分化,可获得具备典型特征的DC,其表面分子表达水平可达 CD83 75.54±0.73%、CD1a 64.94±0.52%、CD80 61.56±0.27%、HLA-DR 62.50±0.66%。DC 与 SGC7901 细胞经 PEG 诱导融合,HAT、HT 选择培养,可获得纯净融合细胞。2、融合细胞体积显著大于亲代细胞,悬浮生长, 细胞表面突起短小;细胞表面分子表达水平为 CD83 80.16±1.12%、CD1a 72.86±2.48%、CD8081.24±2.76%、HLA-DR 79.54±1.56%,较普通 DC 显著升高(P<0.01);融合疫苗显著刺激 T 淋巴细胞增殖,与 T 淋巴细胞在 1:1 效靶比时刺激能力最强,与对照组比较差异非常显著(P<0.01);融合细胞体外培养无明显细胞倍增,不能形成细胞克隆,裸鼠皮下连续注射不能形成种植瘤。3、体外 MTT 比色检测,融合疫苗胃癌细胞杀伤率为81.47±5.25%,与混合培养 DC 组(70.53±2.46%)比较,差异显著(P<0.05),与单纯 T 细胞组(21.67±2.55)比较,差异非常显著(P<0.01);融合疫苗组荷瘤裸鼠终末肿瘤体积平均 1.298±0.021cm3,与对照组(2.429±0.033cm3)比较差异非常显著(P<0.01),抑瘤率为 57.8%;融合疫苗组肿瘤细胞凋亡率 54.9±1.38%,坏死率为 21.04±1.47%;对照组凋亡率 20.02±0.39%,坏死率 1.23±0.03%;两组比较差异非常显著(P<0.01);融合疫苗组肿瘤细胞增殖指数为 23.34±3.51,与对照组(38.81±5.19)比较差异显著(P<0.05);融合疫苗组肿瘤组织与对照组比较显著出血、坏死,瘤组织内大量淋巴细胞浸润。4、融合疫苗免疫共刺激分子 B7-1 mRNA 表达为 0.86±0.08,B7-2 mRNA 表达为 0.81±0.09,与对照组(B7-1 mRNA 0.61±0.03,B7-2 mRNA 0.54±0.04)比较差异非常显著(P<0.01)。结论:1、外周血单个核细胞经 GM-CSF、IL-4、TNF- α等细胞因子诱导培养,可 α获取具备典型特征及细胞表型的 DC;SGC7901 细胞与 DC 经 PEG 诱导融合、HAT/HT 选择培养,可获得纯净融合细胞。2、融合细胞体积较亲代细胞明显增大,悬浮生长,分裂增殖能力弱,体外不形成细胞克隆,在免疫缺陷动物体内不具成瘤活性。3、融合细胞表面分子表达较普通 DC 显著升高,具有更强的刺激 T 淋巴细胞增殖的能力。4、融合细胞疫苗激活 T 淋巴细胞体内外均可诱导显著胃癌细胞杀伤细胞毒活性。5、融合细胞疫苗荷瘤动物体内应用,可以明显减慢肿瘤生长速度,抑制肿瘤细胞分裂增殖,诱导更多肿瘤细胞凋亡。6、融合细胞 B7-1、B7-2 mRNA 表达显著升高,是融合细胞疫苗具有更强生物学效应的可能分子基础之一。