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纳米材料具有独特的物理化学性质,近年来受到了广泛的关注。大量研究表明,纳米二氧化钛(nano-TiO2)是一种常见的大量生产的材料,由于其具有小尺寸、强稳定性、大比表面积和紫外吸收能力等特征,大量应用于商业、工业生产以及日常生活中。人类也不可避免的会接触到纳米TiO2,环境中的纳米TiO2能够通过皮肤、消化道和呼吸系统进入体内,损伤机体各个组织和器官。国内外研究表明,纳米TiO2能够穿透血脑屏障,进入中枢神经系统,影响神经元正常发育,对学习和记忆功能造成损伤。另外,关于纳米TiO2神经毒性的体外研究表明:纳米TiO2抑制了海马神经元细胞的发育,诱导了神经元的凋亡。然而,纳米TiO2对与学习记忆相关的海马神经元的轴突和突触发育的影响及其机制仍不清楚。因此,本论文以原代培养的海马神经元细胞为模型,研究锐钛型纳米TiO2暴露后,神经元细胞轴突和突触的发育情况,并进一步对其分子机制进行研究。本文的结果可以为纳米TiO2引起的神经毒性及其对学习和记忆功能的损伤提供理论和实验数据支持。本文的主要研究内容如下:(1)在本部分的研究中,将从24 h龄的Sprague-Dawley大鼠中分离出的海马神经元细胞暴露于5、15和30 μg/mL纳米TiO2中6h、12 h和24 h,研究纳米TiO2的神经毒性作用。检测纳米TiO2在神经元细胞中的分布、对轴突发育的影响并研究其分子机制。研究结果表明纳米TiO2进入了原代培养的海马神经元细胞细胞质,积聚在细胞核周围,并且成浓度和时间依赖性。随着纳米TiO2浓度的增加(5、15和30 μg/mL),纳米TiO2在海马神经元中积累并抑制轴突的发育,TiO2暴露6h时轴突长度分别减少了 32.5%、36.6%和53.8%;12h时减少了 49.4%、53.8%和69.5%;暴露24 h时减少了 44.5%、58.2%和63.6%。进一步研究发现,纳米TiO2浓度为5、15和30μg/mL时,与对照组相比,Netrin-1蛋白表达分别下降了 9.27%、33.01%和 44.47%;GAP-43 表达下降了 12.73%、20.65%和 33.33%;Neuropilin-1 下降了 8.17%、22.14%和36.9%。此外,Sema3A的表达与对照组相比分别增加了8.02%、19.28%和 29.11%;Nogo-A 的蛋白表达分别增加了 6.29%、24.97%和 29.2%。这些研究表明,纳米TiO2抑制了大鼠原代培养海马神经元的轴突发育,并且这种抑制作用与轴突生长相关因子的表达变化有关。(2)为了进一步讨论纳米TiO2的神经毒性作用,本文对暴露于纳米TiO2的海马神经元的突触发育及可塑性情况进行了研究。具体的研究内容为:通过F-actin染色检测了与突触发育紧密相关的树突棘密度的变化;F-actin和SYN I双免疫荧光染色测定突触密度变化;通过流式细胞术分析了纳米TiO2对海马神经元细胞凋亡的影响;之后进一步检测了细胞内神经元突触发育相关蛋白SYNI和PSD95的表达情况;最后,利用ICC和Western blot等方法对神经元BDNF-TrkB信号通路进行分析。研究结果表明,纳米TiO2浓度分别为10、20、30、40、60、80、100μg/mL时,与对照组相比,神经元树突棘密度分别降低了 18.06%、34.8%、33.33%、43.14%、53.65%、68.33%、75%,证明纳米TiO2抑制了海马神经元的突触可塑性。通过对纳米TiO2在较低浓度(5、15和30 μg/mL)的研究发现,海马神经元凋亡率有所增加,神经元突触发育被抑制,与对照组相比突触密度分别降低了 24.29%、54.29%和72.86%。此外,神经元突触发育相关蛋白SYNI和PSD95的表达也被显著抑制,其中SYNI分别下降了 18.43%、37.2%及51.6%;PSD95分别下降了 16.02%、24.06%和38.74%。对BDNF-TrkB信号通路的研究发现,纳米TiO2通过抑制BDNF的表达阻碍下游MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路中的关键蛋白的表达,纳米TiO2浓度为5、15和30 μg/mL时,BDNF表达分别比对照组降低了 22.64%、33.3%和53.58%,下游关键蛋白 p-CREB/CREB 的下降率为 3.03%、18.11%和 30.57%;p-ERK1/2/ERK1/2 下降率为 19.11%、28.82%和 58.09%;p-Akt1/Aktl下降率为 1.92%、27.79%和41.33%。这些结果证明纳米TiO2抑制了 BDNF-TrkB信号通路的正常功能,而BDNF-TrkB信号通路与神经元突触发育密切相关,由此可见,纳米TiO2通过影响BDNF-TrkB信号通路抑制神经元的突触发育。