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背景:常染色体显性遗传性多囊肾病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)是人类最常见的单基因遗传病之一,基因治疗尚无进展,药物治疗仍是目前重要的方法,但很多药物治疗动物实验有效,在临床试验中并无肯定的疗效。mTOR信号通路的激活是其重要的发病机制之一,mTOR抑制剂雷帕霉素在动物实验中证实可抑制多囊肾囊肿的进展,但在临床研究中效果并不理想,结合多囊肾病为类肿瘤疾病,考虑存在雷帕霉素耐药的可能,探讨雷帕霉素的耐药机制对多囊肾病的治疗及机制研究均有重要的意义。目的:本文将通过基因芯片技术,利用多囊肾囊肿上皮细胞作为研究对象,给予雷帕霉素长时间刺激前后基因谱芯片分析,寻找差异基因,从而寻找雷帕霉素治疗耐药的机制,并寻找新的治疗靶点。方法:1.雷帕霉素作用多囊肾囊肿上皮细胞,收集治疗前、后细胞并提取总RNA:根据前期预实验结果,在雷帕霉素培养14天p70S6K出现反馈性激活,故采用多囊肾囊肿上皮细胞系(WT9-12)作为细胞模型,给予雷帕霉素(50ng/ml)作用细胞14天,给药前后收集细胞提取RNA,采用miRNeasy Mini Kit提取total RNA,实验重复三次。2.样品 totalRNA 利用 NanoDropND-2000(Thermo Scientific)试剂盒,按其操作方法进行定量分析,通过Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测totalRNA是否完整。经检验样品质量合格后,进行标记、参照芯片标准流程对芯片进行杂交和洗脱。totalRNA反转录成双链cDNA,再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和芯片杂交、洗脱,然后使用 Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描,得到原始图像。实验流程由上海华盈生物医药科技有限公司完成。对原始图像使用 Feature Extraction 软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)进行处理。对得到的原始数据使用 Genespring 软件(version13.1,Agilent Technologies)进行 quantile 标准化及后续处理。标准化后的数据进行过滤,每组样本中至少有一组100%标记为Detected的探针留下进行,用于比较的后续分析。差异基因筛选利用T检验的p值和倍数变化值进行,>=2.0且P值<=0.05作为筛选标准,评价上调或者下调倍数变化。之后,对差异基因进行G0和KEGG富集分析,筛选出差异基因的主要影响的生物学功能,及参与的通路。最后,对差异基因进行非监督层次聚类,利用热图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。结果:1.根据质控参考指标,RNA样本合格,无明显降解情况,符合实验条件。通过数据箱线图、散点图及主成分分析提示数据质量分析提示样品分别良好,数据对称性、分散程度良好,生物学重复样品均一性好。2.筛选差异基因结果:差异筛选基因的统计:雷帕霉素作用前及作用14天后的WT9-12细胞(n=3)提取RNA后经RNA芯片检测,差异倍数在2倍以上,p<0.05的差异基因3194个,其中上调基因884个,下调基因2310个。其中P<0.01的差异基因1712,上调567个,下调1145个。通过Go分析提示:细胞间粘附、细胞周期G1/S、内质网介导高尔基体囊泡转运、细胞内蛋白质的运输、胆固醇合成过程、蛋白磷酸化、细胞周期G2/M、细胞内吞作用等细胞功能出现富集。Pathway 分析提示:细胞粘附、细胞周期、泛素介导的蛋白水解等通路出现富集,并对数据进行聚类分析。结论:通过基因芯片技术,观察长时间应用雷帕霉素前后多囊肾囊肿上皮细胞的差异基因表达,发现差异基因3194个,其中上调基因884个,下调基因2310个。部分基因可能成为多囊肾病的治疗新靶点,为研究雷帕霉素治疗多囊肾病的耐药机制及多囊肾病的发病机制提供理论基础,具有一定临床意义。