背景和目的紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)分子式为C47H51NO14,分子量853.92,是一种白色晶体,熔点213-216℃,是从红豆杉科红豆属(Taxus)植物的树皮中提取出来,一种二萜四环类细胞毒性抗肿瘤药。紫杉醇具有广谱抗肿瘤活性,通过与微管蛋白非共价结合,促进和稳定微管,干扰微管的功能,抑制细胞生长,阻碍了细胞周期G2期细胞的复制,但不会影响肿瘤细胞中遗传物质的生成。紫杉醇广泛用于许多癌症治疗,包括乳腺癌、晚期卵巢癌、非小细胞肺癌和结肠癌。紫杉醇这一独特的抗肿瘤机制,使它成为国内外研究的热点抗肿瘤新药。目前临床应用的主要是紫杉醇的注射剂,以聚氧乙烯蓖麻油和乙醇(1：1,w/w)作为溶剂溶解,而市售的紫杉醇注射液中因使用了大量的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL),容易引起聚氯乙烯(PVC)输液袋和管材等的泄露,以及急性过敏反应,给医护人员及患者带来极大的不便。因此,相比注射制剂更为安全方便的紫杉醇口服制剂,近年来成为相关研究的热点。由于紫杉醇的溶解性差和P-gp对它的外排作用,生物利用度不高,血药浓度非常低,为了克服这些问题和提高这一抗癌药的口服生物利用度,实施一系列方法。其中,最受欢迎的是口服可吸收的紫杉醇类似物以及它的相关物质或与P-糖蛋白抑制剂的合用。P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是属于ABC(ATP-binding cassette)转运体超家族的能量依赖性膜蛋白,分子量为170kDa,可发挥外排泵作用,将细胞内的化合物逆浓度梯度转运至胞外,从而降低细胞内的药物浓度。P-gp除在肿瘤细胞中高度表达外,在正常机体组织和器官如肝脏、肾脏、胎盘、大脑、睾丸及肠刷状缘膜等部位均有高水平的表达。存在于肠上皮细胞刷状缘膜中的P-gp能将药物从浆膜侧泵回至粘膜侧而进入肠腔排出,导致药物透膜吸收减少,血药浓度降低。因此,受肠粘膜P-gp调控的经肠道吸收药物可以通过抑制肠粘膜P-gp的活性而增加吸收,提高生物利用度。现已证实,许多药物均为肠粘膜P-gp的抑制剂,例如维拉帕米、环胞菌素A、奎尼丁、一些表面活性剂等。现在已经有三代P-gp抑制剂和许多新型抑制剂,但发展还未成熟,都存在各种限制,如维拉帕米这一公认的P-gp抑制剂,其不良反应限制了它的临床使用,本课题旨在研究中药提取物作为P-gp抑制剂,克服和紫杉醇合用时的不良反应,我们发现京大戟对P-gp有一定的抑制作用,并选用另一种P-gp抑制剂原花青素,通过体内体外实验推断京大戟及原花青素对紫杉醇的口服有促进作用。为了评价合用P-gp抑制剂后紫杉醇体外经不同肠段透过与体内实验的相关性,本研究进行了Ussing Chamber实验。并且在In vivo体内实验中,建立了LC-MS/MS方法检测大鼠血浆中紫杉醇的方法学,期望通过在体环境下对紫杉醇体内吸收情况进行检测来验证体外实验与体内试验的相关性,进一步验证京大戟、原花青素能提高紫杉醇口服生物利用。内容和结果：首先我们建立了紫杉醇的高效液相检测方法,用于测定体外经肠粘膜透过样品中紫杉醇的含量。体外透过样品不需要特殊处理,取样后直接15000r/m高速离心即可进样,测定条件确定为：检测器为紫外检测器(SPD-20A),色谱柱为Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm),进样量为20μL,柱温箱30℃。流动相：乙腈-水(70：30),流速:0.8mL·min-1,分析时间：1Omin,检测波长：272nm。应用高效液相质谱联用建立血浆中紫杉醇的检测方法。血浆样本100μL加入终浓度为100ng/mL的内标(多烯紫杉醇),用混合溶剂乙酸乙酯：二氯甲烷：乙腈(4：1：1)萃取后用安捷伦6460三重四级杆质谱系统进行分析。采用多离子反应监测(MRM)扫描方式,在ESI源正离子模式下,选择m/z876.29→308.1作为MRM监测的离子对,m/z830.34→549.3为内标物多烯紫杉醇的MRM监测离子对。结果：样品分析时间仅需3min,方法线性范围在0.55-550ng/mL(R2=0.997),最低检测限为0.55ng/mL。紫杉醇在1.1、110、550ng/mL三个质控浓度检测下的提取回收率为79.32%,77.54%及78.64%。使用体外Ussing Chamber实验评价紫杉醇经不同肠段透过的差异,计量资料统计结果用均数±标准差(X±S)表示。各组间不同方向,不同区段的Papp比较用析因设计资料的方差分析,不同组间多重比较采用SNK法检测。显著性标准为P<0.05。结果显示,经空肠、回肠粘膜透过时,P-gp抑制剂组与空白组比,紫杉醇经空肠、回肠粘膜M-S方向和S-M方向透过的影响具有显著性,提高了M-S方向的紫杉醇的透过,降低了其S-M方向的透过。经结肠黏膜透过时,P-gp抑制剂与空白组比,紫杉醇经结肠粘膜M-S方向和S-M方向透过的影响不具有显著性。由此说明,京大戟、原花青素、维拉帕米等P-gp抑制剂可以通过抑制P-gp,从而介导紫杉醇透过性质改变的这种影响仅存在于空肠和回肠,而结肠没有影响。不同分组间Papp有显著性差异(F=15.780,P=0.000),结合多重比较结果,京大戟组,原花青素组与对照组比,存在显著性差异(P=0.000,0.001)。京大戟组,原花青素组与维拉帕米组比,存在显著性差异(P=0.000)。不同区段间有显著性差异(F=53.326,P=0.000),结合多重比较结果,空肠与回肠之间无显著性差异(P=0.142)；结肠与另外两组间存在显著性差异(P=0.000)。不同方向间有显著性差异(F=52.006,P=0.000)。在体In vivo实验测定P-gp抑制剂组和空白组作用下,紫杉醇经口服吸收后的血药浓度,研究紫杉醇在体吸收情况,计算各种药动学参数。实验资料结果用均数±标准差表示,采用SPSS19.0统计软件包软件进行统计分析。各组紫杉醇浓度与峰面积的效应关系用线性回归分析(Linear Regression)。紫杉醇在体吸收后Cmax、Tmax、AUC0-720mim、F的均数比较各自均采用单向方差分析(One-Way ANOVA),如果有显著性差异,则组间两两比较采用SNK法(方差齐性时)或Dunnett T3法(方差不齐时)。实验发现,P-gp抑制剂组紫杉醇曲线下面积AUC0-720min和最高血浆浓度Cmax的平均值显著大于空白组,但经One way ANOVA统计学分析,三个实验组血浆中紫杉醇的Cmax、Tmax、AUC0-720min和空白组比有统计学差异,京大戟组比原花青素组和维拉帕米组的高,体内研究结果显示P-gp抑制剂和空白组相比有差异性。口服给药后,紫杉醇的口服生物利用度非常低(<5%),空白组的平均绝对生物利用度(AB%)为2.81%,合用京大戟提取物组的平均AB%是7.63%,是口服紫杉醇的2.7倍,维拉帕米组和原花青素的平均AB%约是空白组的1.5倍,其中平均RB%最高的是京大戟组,为271.75%。空白组口服紫杉醇20mg/kg时的Cmax为95.27ng/mL,比其他P-gp抑制剂组的Cmax显著小很多,四个不同分组,紫杉醇口服剂量都一样,但合用P-gp抑制剂,对空白组口服紫杉醇,Cmax和AUC明显增加,是空白组的1至3倍,其中京大戟提取物组的作用最为显著,原花青素的作用和阳性对照组维拉帕米一样。我们认为通过合用P-gp抑制剂可以显著的提高紫杉醇的生物利用度,是因为P-gp抑制剂可以抑制肠粘膜P-gp外流泵的作用和抑制小肠上P450细胞对紫杉醇的代谢作用。显然,尽可能把紫杉醇口服制剂和P-gp抑制剂合用,会比静脉注射直接方便很多。结论和讨论：结合体外Ussing Chamber实验结果来看,可以推断京大戟、原花青素、维拉帕米可以抑制P-gp的表达,且京大戟的抑制作用更加明显,对P-gp表达的抑制强,相对比,原花青素的抑制作用较弱。在临床上,京大戟和原花青素有抗肿瘤的功效,可以尝试制成肿瘤药物耐药性逆转剂,以增加抗癌疗效；也可以尝试在药物的制备中,适当加入京大戟或原花青素,改善一些P-gp底物药物的吸收。从结果中可以看出紫杉醇在小肠吸收方向透过较少,分泌方向较多,而结肠段,吸收和分泌的差异较小,而京大戟和维拉帕米能促使紫杉醇吸收方向增加,分泌方向减少,原花青素与空白组比,只在空肠段起到吸收促进的作用。体内In vivo实验结果显示,P-gp抑制剂组紫杉醇曲线下面积AUC0-720min和最高血浆浓度Cmax的平均值显著大于空白组,而京大戟组比原花青素组和维拉帕米组的高,体内研究结果显示P-gp抑制剂和紫杉醇合用,确实能增加紫杉醇的口服生物利用度。