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随着经济迅速发展,人们对水产品的需求日益增加,水产养殖规模不断扩大,养殖密度不断增大,导致水环境的生态平衡遭到威胁.抗生素以及化学药物带来的负面影响有目共睹,现在水产养殖行业急需一条健康的可持续发展的道路.益生菌作为一种微生态制剂,不仅可以改善水体环境,并能抑制或杀死水体中的病原菌,还可以促进水产动物的生长提高水产动物的免疫力. 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)作为我国主要的水产养殖动物之一,具有较高的经济价值.凡纳滨对虾养殖的成败与其苗种质量密切相关.凡纳滨对虾幼体时期需要经过多个变态过程,伴随着形态、生活习性、食性的转变以及免疫系统的形成.本研究从水样中筛选分离具有功能性的菌株,与本实验室保藏菌株进行配伍后应用于凡纳滨对虾苗种培育过程中,分析复合益生菌对对虾幼体体内微生物组成的影响,探究复合益生菌在凡纳滨对虾苗种培育中的应用潜力.研究主要内容如下: 1、海水中硝化细菌及产酸细菌的分离鉴定 不同的益生菌具有不同的功能,随着养殖水体中氮浓度的快速上升,导致水体的自净能力严重下降.而且氨氮和亚硝酸对水生动物具有一定的毒性,影响水产动物的健康和生长.而硝化细菌具有降低养殖水体氨氮的功能.乳酸菌是一种能够发酵碳水化合物产生乳酸的微生物.乳酸菌定植在动物体内,产生乳酸,从而减少病原菌的数量.本实验从水样中经过选择性培养基的筛选,筛选出能够有效利用亚硝酸盐的优势菌株和能够产酸的优势菌株.并通过16s rRNA方法进行鉴定,并且构建系统发育树.结果显示BC109为芽孢杆菌,BC702为肠球菌.血平板结果说明两株菌在数量达到1×106 CFU时不具有溶血活性,这表明这两株菌可以作为益生菌在水产养中进行应用. 2、复合益生菌配方的筛选 为了预防对虾急性肝胰腺坏死综合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome, AHPNS)等病害的发生与流行,越来越多的微生态制剂被应用到凡纳滨对虾的养殖过程中.本研究中,我们对复合益生菌配方以及添加方式进行筛选.选取5种益生菌,分别为:假交替单胞菌CDM8、蜡样芽孢杆菌PC465、短小芽孢杆菌LV012、芽孢杆菌BC109以及肠球菌BC702,以及一株具有PirA和PirB毒力基因的副溶血弧菌.首先,我们对5种益生菌之间的相互拮抗作用进行检测,检测结果表明假交替单胞菌CDM8对其他四株菌都具有拮抗作用.对益生菌进行配伍,并以不同方式进行添加.添加益生菌后,对水体中的总菌数(TBC)和总弧菌数(VBC)进行监测,结果表明假交替单胞菌CDM8与短小芽孢杆菌LV012和芽孢杆菌BC109交替添加和假交替单胞菌CDM8与短小芽孢杆菌LV012和肠球菌BC702交替添加两种方法实验全程可以维持VBC/TBC的比值10-16%,可以降低水体中弧菌含量.本实验为今后微生态制剂的应用奠定基础. 3、零换水条件下益生菌组合在凡纳滨对虾育苗生产中的应用研究 为探索应用益生菌的凡纳滨对虾零换水育苗技术,本研究根据筛选的配方,将其应用于凡纳滨对虾无节V期幼体(N5)至仔虾第五天(PL5)的育苗实验.每个实验组包含6个平行,同时设置对照组.整个实验过程不换水,PBE和PBN组的水体中连续施用益生菌组合.当幼体发育至溞状幼体Ⅲ期(ZⅢ)、糠虾幼体Ⅲ期(MⅢ)和PL5时,检测幼体变态率、幼体体内和水体中可培养细菌总数(TBC)和假定弧菌总数(TPVB);在实验结束时统计各实验组幼体成活率,并用Illumina测序PL5幼体体内的微生物群落.结果显示:在整个育苗周期内,未发生疫病;与对照组相比,益生菌组合显著降低了(P＜0.05)TPVB在幼体体内和育苗水体中的相对含量,并显著提高了(P＜0.05)ZⅢ幼体和仔虾PL5的变态率和成活率~15%.此外,各实验组的PL5体内核心微生物群的多样性和结构并不存在显著性差异(P＞0.05),红杆菌科是微生物群落中最具优势的菌群,在各实验组中的相对丰度为40%-86%.研究表明,零换水条件下,益生菌组合能够有效抑制弧菌在育苗水体和凡纳滨对虾幼体体内的过度增殖,提高幼体的成活率,实现育苗的健康生产.