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肌钙蛋白C(Troponin C,TnC)是一科EF手图形超家族蛋白,可以结合Ca<2+>并发挥其生物学功能。它的Ca<2+>结合位点是由螺旋-环-螺旋(HLH)构成的EF手图像模体。肌钙蛋白C主要存在于肌肉组织中,它在调节肌肉收缩方面具有重要作用。目前,国内外对肌钙蛋白C的研究多数集中在脊椎动物上,而对无脊椎动物的研究较少。
我们通过RT-PCR的方法从家蚕蛹中扩增到家蚕肌钙蛋白C基因的完整的ORF序列,并将其命名为BmTnC(Bombyx mori troponin C),GenBank登录号为DQ675020。该基因序列长为480 bp,编码159个氨基酸,预测分子量为18.18 kDa。我们将扩增到的BmTnC基因克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,得到融合蛋白表达质粒pET-28a-BmTnC,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为1 mM的IPTG诱导重组菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在21 kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值(融合标签3.56 kDa,BmTnC 18.18 kDa)相符。融合蛋白以可溶性形式存在,故用超声裂解菌体后12000 rpm离心所得的上清以亲和层析的方法纯化目的蛋白His-tag BmTnC。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,再进行质谱分析,得到该融合蛋白的分子量为21600.9 Da,证实了该蛋白表达的正确性。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1∶25600以上。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白,用于Western blotting实验。实验结果表明,BmTnC蛋白在家蚕的表皮、肠道、头、马氏管、睾丸等组织中都有表达,且表达量依次降低,而在丝腺和脂肪体中我们并没有检测到该蛋白的存在。通过免疫组织化学实验,我们也发现该蛋白主要分布在家蚕五龄幼虫的表皮、气门、肠道、马氏管、头部等组织中,以及蛹的头部、肠道、体壁等组织中。亚细胞定位结果表明,该蛋白主要存在细胞质中。我们还利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期,以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较。甩ProteinA凝胶柱纯化多克隆抗体,并将纯化所得的抗体用于制作免疫亲和柱,从家蚕中纯化天然的BmTnC,为研究该天然蛋白的功能活性打下基础。