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神经肌肉接头是运动神经元与骨骼肌形成的化学突触,支配着多种骨骼肌的运动。膈肌NMJ(phrenic neuromuscular junction)突触前膜蛋白是在颈段脊髓前角运动神经元合成后,顺轴浆运输到达突触前膜,进而支配膈肌的运动,其中有许多蛋白为生物毒素的受体。为了寻找中介蝮突触前神经毒素Gintexin的潜在受体,本研究以小鼠颈段脊髓、膈肌NMJ膜蛋白为材料,做了如下研究:第一部分:以小鼠颈段脊髓为材料,用Illumina HiSeq X Ten高通量测序技术对其进行了转录组分析,用Cufflinks软件将转录组数据组装成转录本并得到表达水平(FPKM)信息,接着用Blastx在线工具对非冗余(Nr)蛋白数据库进行搜索,得到功能注释,之后着重分析了其中的膜蛋白。结果:共得到22352条转录本,其中膜蛋白有八大类,分别是:突触相关蛋白、离子通道、神经递质受体、神经营养因子及细胞因子受体、毒素受体、病毒受体、其他受体及脊髓神经元相关蛋白、myosin家族成员,其表达水平各有不同。第二部分:以小鼠膈肌NMJ为材料,用不连续蔗糖密度梯度超速离心法制备膜蛋白,采用高分辨 LC-MS/MS 技术(Liquid chromatography tandem mass spectrometry)对其膜蛋白进行了分析,获得肽指纹图谱,接着采用Mascot 2.2软件对NCBI小鼠蛋白库进行检索,获得肽段信息。结果:共鉴定出5530种蛋白,将转录组和蛋白组数据进行重叠分析后,发现小鼠膈肌NMJ上至少有1107种蛋白来自颈段脊髓,其中突触前膜相关蛋白为231种,从功能角度可划分为11大类,分别是:突触相关蛋白、离子通道、神经递质受体、神经营养因子受体、毒素受体、myosin家族成员、信号传导受体、转运蛋白、其他跨膜蛋白、犁鼻器及嗅觉受体和其他受体。第三部分:以小鼠膈肌NMJ膜蛋白和中介蝮突触前神经毒素Gintexin为材料,进行化学交联,以抗Gintexin单克隆抗体(N16)做Western Blot检测,切取阳性条带做LC-MS/MS质谱鉴定,获得肽指纹图谱,接着采用Mascot 2.2软件对NCBI小鼠蛋白库进行检。结果:在大约250kDa位置出现了阳性条带,质谱技术共鉴定出22种与Gintexin结合的蛋白。其中2种钙离子通道蛋白(voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1 F、voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1S isoform 2)参与运动神经元末梢Ca2+浓度的感知、内流及突触小泡与突触前膜融合的触发;4种钠离子通道蛋白(sodium channel protein type 1 subunit alpha isoform X1、sodium channel protein type 5 subunit alpha isoform X1、sodium channel protein type 8 subunit alpha isoform 1、sodium channel protein type 10 subunit alpha isoform 1);3 种阳离子通道(cation channel sperm-associated protein subunit gamma 1 iso form X1、transient receptor potential cation channel subfamily M member 6、transient receptor potential cation channel subfamily M member 7 isoform 1);4 种受体型酪氨酸受体磷酸酶(receptor-type tyrosine-protein phosphatase beta precursor、receptor-type tyrosine-protein phosphatase delta、receptor-type tyrosine-protein phosphatase F precursor、receptor-type tyrosine-protein phosphatase S isoform 1 precursor);4 种非常规肌球蛋白(unconventional myosin-Va isoform X3、unconventional myosin-Ⅹ、unconventional myosin-ⅩⅥ、unconventional myosin-ⅩⅤⅢa isoform 1);1 种跨膜蛋白(transmembrane protein 131)可能在对病毒感染的免疫反应中发挥作用;1种富含脯氨酸的突触相关蛋白(proline rich synapse associated protein 2)参与突触形成、成熟和维持;1种低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein 4 iso form 1 precursor)对 NMJ的形成、维持及运动神经元与骨骼肌之间的突触中发挥关键作用;1种甲状腺受体相互作用蛋白(thyroid receptor-interacting protein 11);1种外周型苯二氮受体相关蛋白(peripheral-type benzodiazepine receptor-associated protein)。值得注意的是,这 22 种蛋白中,竟然没有Lambeau所发现的眼镜蛇科PLA2神经毒素的受体,因此Gintexin的受体不是I型PLA2的受体(PLA2 receptorl),而潜藏在这22种候选蛋白中。结论:小鼠膈肌NMJ突触前膜蛋白中存在11大类231种蛋白,其中22种蛋白可能与Gintexin发生相互作用,这为下一步鉴定其受体蛋白奠定了基础。