桃PIN蛋白家族鉴定及PpPIN1b基因功能分析

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桃(Prunus persica L.)是蔷薇科(Rosaceae)、李属(Prunus)的多年生果树,在世界各国广受喜爱,其拥有品种多、适应性强、营养价值高、可观赏等优点。桃在我国的种植面积和产量均居世界首位。在种植桃树时,不同的品种和不同的树形直接影响果园的建造、树体的生长、开花和果品质量。植物的分枝角度是决定植物树型和产量的重要因素。柱型桃分枝角度小、分枝数量少,适合现代果园提倡的“宽行密植”和机械化操作的需求,是桃育种的重要发展方向之一。已有研究表明,PIN生长素转运蛋白家族的OsPIN1b和OsPIN2参与调控水稻的分蘖角度和分蘖数量,OsPIN1b下调表达和OsPIN2过量表达均会改变生长素的极性运输,导致水稻分蘖角度增大。本研究利用生物信息学方法鉴定桃PIN蛋白家族成员,对其基因结构、进化关系、保守结构域等进行分析,并对鉴定出的桃PIN蛋白家族成员进行组织特性表达分析;此外,以标准形的‘大久保’和柱形‘洒红龙柱’为研究对象,克隆PpPIN1b基因,构建过表达载体转化拟南芥验证功能,初步探索生长素转运蛋白PIN1b基因在桃分枝角度形成过程中的作用,为从分子水平揭示柱形桃的分枝角度形成提供理论依据。主要研究结果如下:1.桃PIN蛋白家族成员的鉴定及表达分析(1)利用GDR已公布的桃基因组数据库,通过Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk)网站、SMART在线网站等生物信息学方法鉴定到15个桃PIN蛋白家族成员,绘制染色体物理位置图,进行聚类分析并将所有成员进行命名。用在线工具GSDS、Pfam(链接)等在线软件进行基因结构、氨基理化性质、蛋白二级结构、等生物信息学分析。进行系统进化、多序列比对、保守基序分析。结果显示:15个桃PIN蛋白在8条染色体上呈现不均匀分布,其中1号染色体和5号染色体上均定位到4个成员,在3号、6号、7号都各定位到2个成员,8号染色体上定位到1个成员,2号染色体和4号染色体未定位到PIN成员;所有基因CDS序列长度在1074-2037 bp之间;15个桃PIN蛋白分子量介于39439.82-73665.31 Da之间,大多数蛋白为碱性氨基酸。桃PIN蛋白家族成员均为正值,全部为亲水蛋白;根据保守基序将桃的15个PIN成员分为2类(分别为PpPIN和PpPIN-like);与拟南芥的8个PIN蛋白进行系统发育分析,8个PpPIN蛋白与拟南芥PIN蛋白具有较高的同源性,聚为一支,而7个PpPIN-like蛋白单独聚为一支,与氨基酸序列同源性比对结果一致。(2)PIN蛋白家族基因在两种不同树形桃11个组织部位均有表达,不同部位间的表达量存在显著差异;PpPIN5基因在不同组织部位的表达量显著高于其他家族成员的表达量;在‘大久保’桃中,PIN蛋白家族基因均在枝条中部表达量最高;在‘洒红龙柱’中,PIN蛋白家族基因在枝条中部和分枝连接处混合样表达量最高;在分枝连接处韧皮部的上部和下部,多数PpPIN基因在‘大久保’的表达量均高于‘洒红龙柱’;在分枝连接处混合样这一部位中,PpPIN基因在‘大久保’和‘洒红龙柱’的表达量相似。2.桃PpPIN1b基因克隆及功能分析(1)PpPIN1b基因克隆。利用‘大久保’和‘洒红龙柱’嫩叶cDNA,克隆得到了 PpPIN1b基因编码序列,其CDS全长1794 bp,编码598个氨基酸。(2)PpPIN1b基因过表达载体构建及功能验证。构建pSAK277-PpPIN1b过表达载体,并通过农杆菌介导的转化法转化野生型拟南芥,经PCR鉴定,共获得3个阳性株系;对转基因植株进行表型观察,结果显示,35S::PpPIN1b的转基因拟南芥2个株系与WT相比在分枝角度上存在明显差异,T0代有2个株系生长速度慢于WT,且均出现分枝角度变小的表型,两者之间分枝数量存在差异。
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