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食用真菌子实体形成是一个复杂的发育问题,涉及遗传、生理、生化等一系列代谢过程。在对斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus)子实体发育研究中发现外源添加一定浓度的皂苷、过氧化氢和富氢水,对斑玉蕈子实体形成都有促进作用。已有研究表明氧化还原活性物质可调节细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。本研究在工厂化可控条件下,通过添加氧化还原活性物质,研究其对斑玉蕈子实体形成的表型、ROS水平及相关酶活等生理水平的影响及ROS水平调节相关基因的表达变化,并应用组学技术,对不同处理的样品进行分析;应用基因沉默技术,研究了调节胞内ROS水平的关键基因谷胱甘肽过氧化物酶功能及效应,探讨了添加皂苷、过氧化氢、富氢水对斑玉蕈子实体形成及其发育过程的关联机制,主要得到了以下几个方面的结果:1、研究了搔菌后添加一定浓度的具有抗氧化活性的皂苷能够促进培养时间不足(60 d)的斑玉蕈菌株正常出菇达产,平均单产达到196.0 g,培养时间85 d平均单产208.9 g,对照组平均单产为189.0 g;接着,对斑玉蕈子实体形成过程中4个时期的细胞中丙二醛、过氧化氢含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力进行了测定,结果显示添加皂苷后增强了细胞的抗氧化能力;进一步对皂苷处理后斑玉蕈4个生长发育时期,皂苷合成关键基因,抗氧化酶(SOD、CAT、GR、GPX),信号基因PKA和RAS基因的相对表达量的变化进行了研究;最后,转录组学、代谢组学,组学分析技术对斑玉蕈菌丝体和子实体阶段的表达和代谢情况进行研究,添加皂苷组菌丝代谢物中多种氨基酸及其中间产物含量显著增加,特别是信号调控物质6-磷酸海藻糖含量显著上升3.49倍;转录组数据显示菌丝恢复期的皂苷处理组与对照组间的差异最大,差异基因数达到1380个,其中大量和细胞代谢合成相关的功能基因存在显著性上调。由上述结果说明斑玉蕈搔菌后添加一定浓度的皂苷,可缓解氧化损伤作用,促进菌丝恢复,并可能通过启动6-磷酸海藻糖等信号途径调控子实体发育过程。2、研究了添加合适浓度的典型氧化活性物质过氧化氢,可以促进斑玉蕈子实体的提前形成,过氧化氢浓度为6 mmol/L对子实体增产效果最佳,单产提升7.92%;对过氧化氢处理后发育过程中细胞内H202含量及抗超氧阴离子活力、CAT、SOD酶活性变化进行了测定;应用转录组、蛋白质组技术对斑玉蕈过氧化氢处理后的菌丝进行了研究,并用质谱靶向蛋白质组定量技术(PRM)对表达蛋白进行了验证;应用转录组技术分析了过氧化氢处理对斑玉蕈子实体发育过程的影响,发现搔菌后添加过氧化氢24 h与对照组差异表达基因数达到最大,涉及大量生物调节、代谢过程、信号等功能基因,进一步代谢途径分析显示催化活性和水解酶活性的相关途径富集了较多的基因。由上述结果说明斑玉蕈搔菌后添加一定浓度的H2O2,改变了胞内原有氧化还原水平,形成的氧化胁迫刺激细胞的生物调节、代谢过程、信号等基因表达,催化活性和水解酶相关代谢途径启动,进而促进斑玉蕈子实体的发育进程。3、研究了添加选择性抗氧化活性的富氢水,可以促进斑玉蕈子实体的提前形成,子实体增产效果明显,单产平均增加11.76-21.30%;研究了富氢水在缓解斑玉蕈菌丝体3种不同类型胁迫中的生理作用和分子机制,结果表明,一定浓度的富氢水处理显著降低了 CdCl2、NaCl和H2O2对菌丝细胞的毒性,显著提高了菌丝体生长速度和生物量,测定了菌丝细胞的丙二醛(MDA)的生成明显减少;富氢水显著提高了抗氧化酶活性,并提高了其表达水平,胞内活性氧(ROS)和脂质过氧化的检测,证明了富氢水能显著提高CdCl2、NaCl和H2O2的耐受性;丙酮酸激酶基因表达被激活,提示富氢水可促进葡萄糖代谢;最后,应用转录组技术分析了富氢水处理对斑玉蕈菌丝细胞的影响,结果显示磷、氮元素和离子跨膜转运功能基因被富集,同时发现谷胱甘肽-二硫还原酶、肽二硫键氧化还原酶等氧化还原酶的基因表达增强。综上所述,斑玉蕈搔菌后添加一定浓度的富氢水,可缓解菌丝体阶段外部环境造成的胁迫损伤,促进搔菌后损伤后菌丝的恢复,进而加快了子实体形成进程。4、研究了谷胱甘肽过氧化物酶基因(gpx)在斑玉蕈子实体发育中的功能。首先获得斑玉蕈gpx沉默转化菌株,经筛选,获得两个gpx沉默转化子GPXi12和GPXil9,沉默效率分别为75%和88%;对沉默转化子进行结实性试验,并添加过氧化氢,观测子实体生长发育过程,并对发育过程的氧化还原物含量以及氧化还原酶活力进行了测定;对其木质纤维素降解酶活力,以及线粒体复合物酶活进行了测定,并应用透射电镜技术观测了转化子线粒体的形态变化情况。上述结果显示:谷胱甘肽过氧化物酶基因沉默菌株表现出子实体形成滞后,木质纤维素酶系活性下降,细胞内线粒体复合物Ⅳ活性显著上调,透射电镜观测显示沉默菌株细胞内线粒体形态异常。本研究首次在斑玉蕈中较系统地研究了不同氧化还原活性物对其子实体形成和发育的影响,获得了不同处理下子实体发育过程中的转录组、蛋白质组、代谢组的差异表达数据,为后续研究其子实体发育中的基因功能奠定数据基础;通过对gpx基因在子实体发育中的功能研究发现,该基因对维持斑玉蕈子实体发育正常进程至关重要。