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T4 DNA连接酶（T4Lig）催化DNA临近的3’OH与5’PO4形成3’-5’-磷酸二酯键,从而作为工具酶广泛用于克隆、测序、基因合成等方面。目前T4Lig的酶连机理都是以缺口DNA（nicked DNA,nDNA）为底物来研究的,而对线性DNA（linear DNA,L-DNA）的酶连机理知之甚少。常规酶连中人们普遍认为T4Lig能将L-DNA转变为双链共价闭合环状（ccc）DNA,这种认识与L-DNA酶连产物的转化子经常在接口缺失核苷酸是相矛盾的。本课题构建了含木聚糖酶基因S4的pET22b-S4质粒,对质粒进行PCR扩增得到平末端的L-DNA,用XhoI酶切得到粘性末端的L-DNA。用T4Lig对平端或粘性末端的L-DNA进行三次酶连得到cccDNA。研究结果如下:1.证明L-DNA的常规酶连产物是nDNA,不是cccDNA:1)用T4Lig对平端L-DNA进行分子内连接,部分转化子在接口缺失核苷酸。而cccDNA的双链是完整的,不会缺失核苷酸,所以L-DNA的酶连产物不是cccDNA。2)双侧磷酸化平端L-DNA的酶连产物与单侧磷酸化的电泳带型相同。将单侧磷酸化平端L-DNA的酶连产物进行琼脂糖凝胶电泳,各条带割胶回收,用Sanger双脱氧链终止法测序,确定各条带为L-DNA、nDNA、二聚体（dimer）,无cccDNA。说明平端L-DNA的酶连产物是nDNA。3)粘性末端L-DNA酶连产物的电泳带型与平端DNA一样,说明粘性末端L-DNA的酶连产物也是nDNA。4)酶连产物与T5核酸外切酶反应,所有的条带都被降解,进一步证明L-DNA酶连产物为nDNA。2.缺口处的AMP阻止nDNA进一步酶连:1)L-DNA的酶连产物通过加热或纯化回收去除T4Lig,再用T4Lig或E.coli Ligase对nDNA二次常规酶连,仍然没有cccDNA。说明不是T4Lig结合在缺口阻止了酶连,可能与缺口5’PO4的腺苷化有关,即5’PO4结合的AMP阻止T4Lig的连接作用。2)尝试用RNase HⅡ去除一次酶连产物nDNA的AMP再二次常规酶连,但nDNA没有转变为cccDNA,表明AMP与缺口5’-PO4是以焦磷酸键结合,而不是磷酸二酯键结合。3.将nDNA转变为cccDNA:1)一次常规酶连产生的nDNA用无ATP的T4Lig二次酶连,产生少量cccDNA。说明非腺苷化的T4Lig可以连接5’PO4存在AMP的nDNA为cccDNA。2)用无ATP的T4Lig二次酶连去除nDNA缺口5’PO4的AMP,再进行第三次常规酶连,出现较多cccDNA。3)T4Lig的159位赖氨酸与腺苷化相关,突变体K159L不能被ATP腺苷化,可以结合nDNA去除缺口5’PO4的AMP。一次酶连产生的nDNA用K159L二次酶连去除AMP,再进行第三次常规酶连,将90%的nDNA转变为cccDNA。研究证实,L-DNA一次常规酶连的产物为nDNA;缺口处的AMP阻止了nDNA进一步形成cccDNA;二次酶连用K159L或无ATP的T4Lig去除AMP,再用T4Lig进行第三次常规酶连将nDNA转变为cccDNA。研究结果纠正了人们对常规酶连的不完善认识,对T4Lig的L-DNA酶连机理有了深入理解,对T4Lig的应用具有重要意义。