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目的和意义近年来随着社会、经济发展和人口的老龄化,我国恶性肿瘤的发病率和死亡率一直呈上升趋势。转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征,也是导致患者死亡的主要原因。结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是最常见的、严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。有关结直肠癌转移相关基因的研究进展迅速,根据报道,有数百种基因参与结直肠癌的调控过程,包括运动因子、粘附分子、细胞外基质降解酶、血管生成因子、转录因子、信号转导因子及其它癌基因、抑癌基因等。PRL-3(Phosphatase of regenerating liver-3,肝细胞再生磷酸酶-3)属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族(protein tyrosine phosphatase,PTP)成员,也被称为PTP4A3。自从发现PRL-3在结肠癌肝转移组织中表达升高后,磷酸酶PRL家族备受关注。越来越多的研究证实,PRLs具有致瘤性,可以促进细胞的增殖,迁移,侵袭,肿瘤的生长及转移。尽管在了解蛋白及信号通路方面取得了一些进展,但其潜在的分子机制仍然不明确。课题组前期研究表明PRL-3与人结直肠癌的发生发展密切相关,并建立PRL-3(+)/APC(min/+)转基因小鼠模型,证实小鼠体内PRL-3过表达促进其肠道腺瘤的发生发展,出现腺瘤癌变及远处转移。通过酵母双杂交技术发现PRL-3相互作用蛋白CDH22,进一步机制研究证实PRL-3对钙黏附蛋白相关信号通路的调节作用,推测PRL-3与Wnt信号通路相关。本课题通过对转基因小鼠癌变腺瘤及转移瘤组织进行表达谱基因芯片分析,寻找结直肠癌相关基因,筛选PRL-3相互作用蛋白,进一步研究PRL-3及其相互作用蛋白在结直肠癌发生发展中的作用机制。深入认识结直肠癌发生发展机制,将为结直肠癌的诊断治疗提供新的思路和理论依据。方法1.表达谱基因芯片检测分析提取PRL-3(+)/APC(min/+)小鼠正常肠粘膜组织、结直肠腺瘤癌变组织、转移癌组织mRNA,使用NimbleGen系统进行芯片杂交、清洗,通过Axon GenePix 4000B芯片扫描仪进行扫描。扫描图像输入NimbleScan软件进行点阵数据表达分析。通过软件内置RMA算法进行数据标准化,生成基因表达谱数据。将所有表达谱数据输入Agilent GeneSpring GX软件进行进一步分析。滤过信号值下限为50.0,滤过后的差异表达基因根据基因表达信号值差异倍数确定,定义表达差异倍数≥5.0的基因为表达显著差异基因。通过软件进一步对表达显著差异基因进行信号通路分析及生物信息学等分析。2.临床组织标本和结肠癌细胞株检测通过检测临床组织标本及结直肠癌细胞株中PRL-3、CCL5、IFITM2表达,分析其与结直肠癌的相关性。收集南方医科大学南方医院临床结肠癌患者手术切除肿瘤组织及癌旁正常组织,全部标本术后病理诊断确诊为结肠腺癌,且患者于术前未行放化疗。标本收集通过南方医科大学南方医院医学伦理委员会比准及患者知情同意。通过免疫组织化学、实时定量PCR、蛋白免疫印迹实验检测PRL-3、CCL5、IFITM2表达情况。收集6株不同转移潜能结肠癌细胞株,通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹实验检测PRL-3、CCL5、IFITM2表达。3.构建结肠癌过表达及干扰细胞株以人结肠癌细胞株SW480 cDNA为模板,Oligo 7.0软件设计PRL-3、CCL5、IFITM2基因全长特异性引物,分别在上、下游引物中加入XhoI、BamHI酶切位点,PCR获取基因全长,连接至载体pEGFP-N1,分别得到pEGFP-PRL-3、pEGFP-CCL5、pEGFP-IFITM2质粒。脂质体转染构建过表达及干扰细胞株。4.细胞生物学功能研究通过细胞功能学实验检测过表达及干扰CCL5、IFITM2后对结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。包括细胞增殖实验(MTT)、平板克隆形成实验、Transwell小室侵袭实验、划痕愈合实验。5.蛋白相互作用及机制研究通过实时定量PCR、蛋白质免疫印迹实验、蛋白质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因系统、免疫荧光、核浆蛋白分离提取及蛋白免疫印迹等技术研究PRL-3与CCL5、IFITM2相互作用及与Wnt信号通路相关性。6.统计学方法用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析,实时定量PCR、平板克隆形成实验使用两独立样本t检验法。需要进行Levene方差齐性检验,若方差齐,使用方差齐同条件下的t检验结果;若方差不齐,使用Satterthwaite近似t检验。细胞增殖实验(MTT)采用析因设计的方差分析。取P<0.05为差异有统计学意义。结果1.表达谱基因芯片筛选出PRL-3相关基因CCL5、IFITM2对转基因小鼠正常肠粘膜组织、腺瘤癌变组织、转移癌组织进行表达谱基因芯片分析。数据经过滤过、标准化后绘制箱图、散点图、热图。定义基因信号值表达差异大于5倍的基因为差异表达基因,通过计算分析,原位癌组织比正常组织表达上调基因共有621个,转移癌组织比正常组织表达上调基因共有924个,转移癌组织比原位癌组织表达上调基因共有474个。其中,在原位癌组织与正常组织中表达上调,同时在转移癌组织与原位癌组织中表达上调的基因有20个。通过文献挖掘分析,筛选出CCL5、IFITM2可能为结直肠癌肿瘤相关基因,且可能与PRL-3相互作用,由于CCL5、IFITM2在结直肠癌发生发展过程中的作用机制尚不明确,故选定CCL5、IFITM2进行下一步研究。2.PRL-3与CCL5、IFITM2存在相互作用且与结直肠癌发生发展密切相关为进一步验证三者PRL-3、CCL5、IFITM2对结直肠癌发生发展的作用,通过提取8对人结肠癌组织及癌旁组织总RNA及总蛋白,进行实时定量PCR及蛋白免疫印迹检测,发现结肠癌组织中PRL-3、CCL5、IFITM2的表达高于癌旁正常组织。在6株结肠癌细胞株中,PRL-3、CCL5、IFITM2在高转移结肠癌细胞株HCT116表达较高,在低转移结直肠癌细胞株HT29表达较低,在转移潜能介于两者之间的细胞株SW480中度表达。表明PRL-3、CCL5、IFITM2与结直肠癌的发生发展密切相关。免疫荧光显示PRL-3分别与CCL5、IFITM2存在共定位现象。利用蛋白质免疫共沉淀技术以PRL-3抗体沉淀CCL5、IFITM2蛋白,提示PRL-3可以与CCL5、IFITM2相互结合。免疫组化染色提示结直肠癌组织中CCL5、IFITM2高表达。表明PRL-3、CCL5、IFITM2存在相互作用。3.成功构建PRL-3、CCL5、IFITM2过表达载体及稳定过表达细胞株通过分子克隆技术成功构建pEGFP-PRL-3、pEGFP-CCL5、pEGFP-IFITM2载体,经公司测序分析,获得核苷酸序列与GeneBank目的基因序列Blast比对完全一致。在结肠癌细胞株SW480中通过脂质体转染pEGFP-PRL-3、pEGFP-CCL5、pEGFP-IFITM2质粒,筛选后分别得到稳定过表达SW480-PRL-3、SW480-CCL5、SW480-IFITM2细胞株。倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光,实时定量PCR及蛋白印迹实验结果证实稳定过表达细胞构建成功(PCCL5=0.001,PIFITM2<0.001)。4.建立CCL5、IFITM2干扰细胞株在结肠癌细胞株SW480中通过脂质体瞬时转染siRNA,得到干扰CCL5、IFITM2细胞株。实时定量PCR及蛋白免疫印迹实验结果显示CCL5、IFITM2干扰细胞株构建成功(PsiCCL5-1/2=0.001,PsiIFITM2-1/2<0.001)。5.CCL5、IFITM2促进结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移能力通过细胞功能学实验探究CCL5、IFITM2对结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。过表达CCL5、IFITM2后,MTT实验结果显示,细胞体外增殖能力增强(PCCL5<0.001,PIFITM2<0.001),平板克隆形成实验结果显示,细胞形成单克隆数增多(PCCL5=0.038,PIFITM2=0.005),Transwell小室侵袭实验结果显示,迁移至下室的细胞数增多(PCCL5<0.001,PIFITM2<0.001),即细胞侵袭能力增强,划痕愈合实验结果显示,过表达CCL5、IFITM2促进细胞的体外迁移能力。干扰 CCL5、IFITM2 后,细胞体外增殖能力降低(PsiCCL5-1/2<0.001,PsiIFITM2-1/2<0.001),克隆形成数下降(PsiCCL5-1=0.001,PsiCCL5-2=0.002,PsiIFITM2-1=0.003,PsiIFITM2-2=0.005),细胞侵袭能力减弱(PsiCCL5-1/2<0.001,PsiIFITM2-1/2<0.001),细胞的体外迁移能力减弱。6.PRL-3与CCL5、IFITM2相互作用并通过Wnt信号通路促进结直肠癌发生发展过表达PRL-3、CCL5、IFITM2后,TOP/FOP双荧光素酶报告基因检测结果显示,Wnt/β-catenin转录复合体的转录活性增强(PPL-3=0.003,PCCL5=0.01,PIFITM2=0.005)。实时定量PCR及蛋白免疫印迹实验结果显示LEF1、CyclinD1、DKK1的表达增高。核浆蛋白分离提取及蛋白免疫印迹实验结果显示β-catenin在胞核内表达升高,免疫荧光染色实验结果显示β-catenin胞浆聚集并向胞核内迁移。干扰CCL5、IFITM2后,Wnt/β-catenin转录复合体的转录活性减弱(PsiCCL5-1<0.001,PsiCCL5-2=0.001,PsiIFITM2-1<0.001,PsiIFITM2-2=0.004),LEF1、CyclinD1、DKK1的表达降低,β-catenin在胞核内表达降低,免疫荧光显示β-catenin主要位于细胞膜。实验结果显示,PRL-3与CCL5、IFITM2相互作用并通过Wnt信号通路促进结直肠癌发生发展。结论1.通过表达谱基因芯片分析,筛选出PRL-3相关基因CCL5、IFITM2,初步验证PRL-3与CCL5、IFITM2存在相互作用。2.CCL5、IFITM2在结直肠癌组织及高转移潜能细胞株中高表达,能促进人结肠癌细胞增殖、侵袭与迁移。3.PRL-3与CCL5、IFITM2相互作用,可通过Wnt信号通路促进结直肠癌发生发展。