研究背景:恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大疾病之一。近年来随着环境以及生活条件等的改变,全球恶性肿瘤的发病率及死亡率正在逐步攀升,已是导致患者死亡的最大原因。据WHO最新报道显示,乳腺癌已成为全球女性,特别是发展中地区女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。尽管我国是乳腺癌的全球低发区,但据全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示,我国近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势,越来越多的妇女受到乳腺癌的威胁。因此,对乳腺癌的发生、发展机制以及乳腺癌的多线治疗模式的研究已经成为目前肿瘤研究的重点及热点。肿瘤发生是一个多因素、多步骤的过程。随着分子生物学及生物信息学技术的迅猛发展,肿瘤发病机制的研究进入了后基因组学与表观遗传学时代。DNA甲基化作为其重要组成部分,在细胞代谢、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生中起着重要作用,为肿瘤新型治疗靶点的确认与药物研发开创了划时代的一页。因此,对DNA甲基化的研究在乳腺癌的发生、发展过程中的理论意义与应用前景的探索和尝试已成为新的研究领域与方向。P73基因是1997年由学者Kaghad等发现的定位于1p36上的基因。它是p53基因家族的主要成员之一,其包含了两个启动子结构P1、P2,分别能编码生物学功能相反的蛋白质异构体,因而成为肿瘤学研究的热点。其中,P1启动子位于p73基因第一外显子起始区,其在转录水平通过对C末端的剪切方式不同而产生不同的异构体(α,β,丫,δ,ε,ζ,θ,η,η1),统称为TAp73。TAp73蛋白含有转录激活结构域(Transactivation domain,TA),因而具有诱导细胞凋亡的能力。而P2启动子位于p73基因第三内含子起始区,其转录表达缺失TA区的异构体(△Np73,△ex2p73,△ex2/3p73 和 △N’p73),统称为 △Np73。△Np73 蛋白由于缺乏TA区,因而具有抗凋亡能力。大量实验证明,TAp73可通过调控一系列的p53靶基因如p21、14-3-3σ等而产生具有细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡的抑癌基因作用。因而,当TAp73缺失或表达下调时,可能促进肿瘤的发生。相反,△Np73则通过抑制TAp73或p53介导的转录调节作用,从而发挥抗凋亡的癌基因作用。当△Np73过表达时,可抑制细胞的凋亡作用,且与肿瘤的不良预后相关。正常状态下,TAp73和△Np73二者之间能够相互作用:TAp73能够与△Np73结合,并使其表达上调,而△Np73则抑制TAp73的表达,形成一个自我调控的负反馈环。当这种平衡关系被打破并倾向于△Np73时,机体将发生恶性病变。可见,对TAp73和ANp73表达调控机制的研究,将是探索p73基因功能机制研究的关键。作为表观遗传学研究中的重要修饰方式,DNA甲基化修饰可通过沉默基因的表达来调控肿瘤发生,而这往往发生在基因启动子富含CpG岛区域。p73基因虽然是p53家族成员,但却极少发生突变。研究表明,其表达调控与基因启动子区CPG岛甲基化相关。Corn PG等在急性淋巴细胞白血病和伯基特淋巴瘤组织中发现p73基因位于第一外显子区的CPG岛有异常的DNA甲基化,约占30%左右,而正常组织中却不发生甲基化。同样,在白血病细胞株中亦发现p73的转录失活与甲基化相关。总之,一系列的实验结果表明p73基因在一些特殊的血液恶性肿瘤中往往处于甲基化状态,并且甲基化沉默p73的表达可导致细胞周期阻滞。近年来Daskalos A等在一项关于102例非小细胞肺癌的甲基化研究中提到:在非小细胞肺癌中p73基因P1启动子区高甲基化引起的TAp73低表达很少发生;而P2启动子区的低甲基化引起的△Np73高表达却频繁发生,尤其是在鳞状细胞癌中。由此可见,在不同类型的恶性肿瘤中p73基因启动子区甲基化情况不同,最终引起的生物学效应亦不同。以往多数甲基化研究主要集中在p73基因P1启动子区,而对P2启动子区的研究相对较少。唐林等通过相关软件在线预测发现p73基因两个启动子区均含有丰富的CPG岛,这为以P1、P2为主的甲基化研究提供了理论基础。而5-氮杂脱氧胞苷是一种DNA甲基转移酶抑制剂,能够诱导DNA甲基化靶基因的复表达,被广泛用于DNA甲基化的临床研究。在淋巴瘤,白血病等血液恶性肿瘤中的研究表明:5-氮杂脱氧胞苷可使高甲基化的p73发生去甲基化作用,从而使沉默的p73基因重新表达。近年在胃癌、肺癌、宫颈癌等实体瘤中关于p73甲基化的研究亦证明了 p73因不同程度的甲基化而使转录表达减少,同样5-氮杂脱氧胞苷可逆转其表达,从而恢复其生物学活性。然而,p73基因不同启动子区的甲基化状态,以及5-氮杂脱氧胞苷对其的影响在乳腺癌中尚未清楚。P1、P2启动子区序列存在多种潜在的转录因子结合位点,这些转录因子在不同的条件下可与P1、P2结合,从而发挥不同的生物学作用。比如YuJ等发现P1启动子区含有5个Egrl结合位点,P2启动子区则不存在Egrl结合位点,通过Egrl介导的TAp73表达增加可有效的促进细胞凋亡的发生。此外,Logotheti S等在肺癌研究中表明,转录因子SP1可与P1启动子结合诱导TAp73γ表达增加,发挥抑癌基因的抗肿瘤作用。我们通过在线软件预测到P2启动子区存在AP-1潜在的转录因子结合位点,而VikhanskayaF等则发现p73可增加AP1的转录活性,促进肿瘤细胞的生长。同样,在线分析发现P1及P2区均含有Nrf-2结合位点,其中P1含有1个结合位点,P2含有三个结合位点。Nrf-2,即NF-E2相关因子,是转录因子中CNC(cap ’n’ collar)家族中重要一员,因在抗氧化应激、抑制肿瘤形成等多方面的作用受到广泛关注。研究表明,Nrf-2可受到包括DNA甲基化在内的表观遗传学调控:高甲基化可使Nrf-2的转录调控受到抑制,5-氮杂脱氧胞苷则使其发生去甲基化从而恢复Nrf-2的转录表达。然而,在乳腺癌中Nrf-2是否调控p73的表达却鲜少有报道。鉴于P1及P2区均含有Nrf-2结合位点,探索Nrf-2对TAp73及△Np73的表达调控是否存在差异,显得颇有意义。目的:本实验利用预设浓度的5-氮杂脱氧胞苷作用于不同的乳腺癌细胞株,观察其对乳腺癌细胞增殖、周期分布及细胞凋亡的影响,揭示p73基因不同启动子区P1、P2的甲基化状态并在细胞水平、小鼠水平及组织水平初步探讨Nrf-2对P1、P2表达调控的分子机制。为深入理解p73发挥的生物学作用和其用于5-氮杂脱氧胞苷治疗乳腺癌提供基础理论依据。方法:本实验选择了三株乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3)、Nrf-2基因敲除小鼠及乳腺癌组织芯片为研究对象,通过多种实验方法进行研究分析。具体如下:1.通过MTT、流式细胞术实验,观察不同浓度的5-氮杂脱氧胞苷对三株乳腺癌细胞的细胞增殖、细胞周期分布及凋亡的影响。2.通过DNMTs活性实验观察5-氮杂脱氧胞苷对三株乳腺癌细胞DNMTs活性的影响。3.通过亚硫酸氢盐修饰DNA及焦磷酸盐测序实验,观察乳腺癌细胞MCF-7中p73基因启动子P1、P2中预测位点的甲基化状态及5-氮杂脱氧胞苷对其甲基化的调节作用。4.通过RT-PCR、蛋白免疫印迹分析、细胞免疫荧光实验等,观察预设药物浓度的5-氮杂脱氧胞苷对乳腺癌细胞MCF-7中TAp73及ANp73 mRNA及蛋白表达的影响。5.通过生物信息学在线分析软件、CHIP实验、实时定量PCR等实验,预测Nrf-2与P1、P2的结合位点,观察Nrf-2与P1、P2的结合情况,初步探讨5-氮杂脱氧胞苷作用下Nrf-2调控乳腺癌细胞MCF-7中p73表达的可能机制。6.通过瞬时转染Nrf-2过表达质粒及Nrf-2干涉质粒,利用蛋白免疫印迹实验,观察乳腺癌细胞MCF-7中Nrf-2对TAp73及△Np73表达的调控作用。7.通过蛋白免疫印迹实验,在Nrf-2敲除小鼠及Nrf-2野生型小鼠中观察5-氮杂脱氧胞苷作用下Nrf-2对TAp73及△Np73表达调控的影响。8.通过免疫组织化学实验检测乳腺癌组织中TAp73、△Np73及Nrf-2的表达情况,利用相关统计学分析法分析TAp73及ANp73之间的关系。结果:1.5-氮杂脱氧胞苷抑制乳腺癌细胞的增殖,诱导乳腺癌细胞G1期阻滞,同时促进乳腺癌细胞凋亡的发生,并随着药物浓度的增加呈剂量依赖趋势,统计学有差异(P<0.05)。2.5-氮杂脱氧胞苷显著抑制三株乳腺癌细胞的DNMTs活性,统计学有差异(P<0.05)。3.乳腺癌细胞MCF-7中p73基因启动子区P1、P2存在高甲基化的CPG岛。5-氮杂脱胞苷使P1及P2中的甲基化位点发生去甲基化作用。4.MCF-7中TAp73及△Np73的表达在转录及翻译水平均表现为:TAp73表达增加,ANp73表达降低,呈剂量依赖趋势,统计学有差异(P<0.05)。5.MCF-7中,预测到P1含有1个Nrf-2结合位点,P2含有3个Nrf-2结合位点;相关实验表明Nrf-2能分别与P1、P2不同程度的结合,但在5-氮杂脱氧胞苷作用下Nrf-2与P1结合增加,与P2结合降低,最终表现为:TAp73表达增加、△Np73表达降低。6.MCF-7中,过表达Nrf-2可促进TAp73及△Np73的表达,而干涉Nrf-2则不能使TAp73及△Np73的表达增加。7.在Nrf-2基因敲除小鼠中,TAp73及ANp73表达均较野生型组低,但在5-氮杂脱氧胞苷作用下,TAp73及△Np73表达均呈增加趋势。8.免疫组化结果表明,TAp73表达在乳腺癌组织中较相对应的癌旁正常组织低,△Np73、Nrf-2表达在乳腺癌组织中较相对应的癌旁正常组织均高;乳腺癌组织中TAp73与△Np73的表达相关,且呈负相关关系。结论:5-氮杂脱氧胞苷可通过上调TAp73及下调ANp73的表达,导致乳腺癌细胞周期G1期的阻滞、促进细胞凋亡的发生,从而显著抑制细胞的增殖。而且我们发现5-氮杂脱氧胞苷上调TAp73及下调△Np73的表达机制可能是通过DNA甲基化修饰及Nrf-2基因的表达调控来实现的:一方面5-氮杂脱氧胞苷可使P1及P2甲基化位点发生去甲基化作用从而调控TAp73及ANp73的表达;另一方面5-氮杂脱氧胞苷作用可使Nrf-2与P1结合增加、与P2结合降低从而导致TAp73表达增加而△Np73表达降低。我们在乳腺癌组织中还发现TAp73呈低表达而△Np73及Nrf-2呈高表达状态,并且TAp73与ANp73之间存在负相关关系,这可能是促进乳腺癌发生发展的重要因素之一。