2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的发病呈逐年上升趋势,胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是T2DM的重要发病基础,而且与高血压、高血脂、肥胖、心血管疾病的发生、发展密切相关,有上述疾病的“共同土壤”之称。IR是指胰岛素在周围组织摄取和清除葡萄糖的作用减低,是遗传和环境因素共同作用的结果,以多个水平的缺陷为特征,包括受体前、受体和受体后的抵抗。胰岛素生理作用的发挥,始于其与受体的结合,并由此引起细胞内一系列信号转导,最终到达各效应器产生各种生理效应。以往对IR的研究大多是围绕着靶器官及其胰岛素受体进行的,随着分子生物学研究方法和技术的日新月异,人们发现胰岛素信号传导障碍、脂肪源性细胞因子分泌异常及炎性介质的作用也在IR发生过程中扮演了重要的角色。蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)和葡萄糖转运子4(glucose trans- porter 4, GLUT4)在胰岛素介导的葡萄糖摄取中发挥着重要作用,是胰岛素信号转导通路中的关键环节。近年来,脂肪组织的内分泌作用逐渐受到广泛的关注,其中与胰岛素抵抗密切相关的脂肪细胞因子主要包括瘦素(leptin, Lep)、脂联素(adiponectin, APN)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)等,目前研究成果表明这些因子在胰岛素抵抗的形成和发展中扮演着不同的角色,脂联素具有增敏作用,而其它因子含量的增加却会使胰岛素抵抗的程度加重。当前针对胰岛素抵抗的治疗首推噻唑烷二酮类药物(thiazolidine- diones, TZDs),可以与脂肪组织PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, PPARγ)特异性结合,使PPARγ活性增强,通过其特殊的信号转导通路,发挥促进脂肪细胞分化、改善糖脂代谢等多种药理作用,临床疗效显著。但一年来其使用的安全性引起了世界范围内普遍争议,也使其在临床的应用受到很大限制。中医药治疗疾病具有多方位、多环节、多靶点的特点,在糖尿病的预防和治疗方面有其独特的优势。在当前形势下,寻找能够改善IR状态的中药或者中药提取物,并对其相关机制进行探索,不仅有利于中药现代化的研究,也将对IR乃至糖尿病、冠心病的治疗产生深远的影响。银杏叶提取物(Extract of Ginkgo Biloba, EGB)的临床使用非常广泛,在高脂血症、老年痴呆症、冠心病(coronary heart disease, CHD)、脑血管病的治疗中疗效显著,目前其治疗范围逐渐扩展,开始在糖尿病并发症、慢性阻塞性肺病、肝纤维化等疾病中应用,效果肯定。且其制剂有统一的国际标准,这为其临床使用的安全性提供了保障。EGB可以调节血脂、改善糖代谢和内皮细胞功能,并且具有抗氧化、清除自由基等多种药理作用,这些环节均与IR的发生机制密切相关。因此,EGB可能对IR状态有改善作用。为了证明这一推论,我们通过银杏制剂对高脂饮食诱导的IR大鼠的干预研究,探讨银杏制剂对胰岛素敏感性的影响及其作用的靶点。目的:探讨EGB对高脂饮食大鼠胰岛素敏感性的影响及其可能的作用机制。主要研究内容包括IR模型的建立和评价;EGB对胰岛素敏感性的改善及评估;EGB对糖、脂代谢的影响;对脂肪因子分泌的调节;对骨骼肌PKB、GLUT4以及脂肪组织PPARγ表达的影响。方法:清洁级雄性Wistar大鼠(体重290～320g)80只,适应性喂养1周后按体重随机分为正常对照组(normal control group, NC) 20只,高脂饮食组(high-fat-fed group, HF) 60只。正常对照组给予基础饲料(热量组成:碳水化合物占65.5%,脂肪占10.3%,蛋白质占24.2%),总热量为348 kcal/100g;高脂饮食组喂以高脂饲料(热量组成为脂肪59.8%,碳水化合物20.1%,蛋白质20.1%),总热量为501 kcal/100g。两组每日等热量投喂饲料,每周称体重1次。4周后2组各随机选10只大鼠禁食10小时过夜,内眦取血,分离血清测定高脂饮食4周大鼠的血脂、空腹胰岛素、瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子α、游离脂肪酸等指标,并行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验(hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp),了解大鼠葡萄糖输注率(glucose infusion rate, GIR)的变化,判断造模是否成功。确认造模成功后,高脂饮食组剩余50只大鼠按照体重随机分为高脂对照组(HC),银杏叶1组(EGB1),银杏叶2组(EGB2),银杏叶3组(EGB3),罗格列酮组(RSG),每组10只,在原饲养条件的基础上,开始药物干预。其中银杏叶1、2、3组分别给予舒血宁注射液4 mg·kg-1·d-1、8 mg·kg-1·d-1、12 mg·kg-1·d-1腹腔注射,RSG组给予马来酸罗格列酮蒸馏水混悬液3 mg·kg-1·d-1灌胃,NC组和HC组给予与EGB2组等量生理盐水腹腔注射,每日1次,共4周。每周称体重1次,根据体重调整给药量。疗程结束后内眦取血,分离血清,测定各组大鼠干预后血脂、空腹胰岛素、瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子α、游离脂肪酸等指标,其中血清瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子α采用ELISA法测定;血清游离脂肪酸用铜显色法测定。并行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test, OGTT)及干预后高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验,了解各组大鼠对葡萄糖负荷的耐受情况及葡萄糖输注率的变化。4周与8周的钳夹结束后均放血处死大鼠,准确称量肾周和附睾脂肪重量,与自身体重比作为内脏脂肪相对含量。并分别留取大鼠股四头肌和肾周或附睾脂肪,采用Western Blotting和实时荧光定量RT-PCR技术测定肌肉组织PKB、GLUT4以及脂肪组织PPARγ蛋白和mRNA表达情况。所得数据经过整理采用SPSS统计软件进行t检验或方差分析。结果:1高脂喂养4周末大鼠各项指标情况:与正常对照组相比,高脂饮食组大鼠体重虽有所增加,但差异无统计学意义(P>0.05),血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)及空腹胰岛素升高,差异有统计学意义(P<0.05),空腹血糖、血清游离脂肪酸、肿瘤坏死因子α明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),葡萄糖输注率、血清脂联素下降,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。血清瘦素升高,但与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。高脂饮食组还表现为内脏脂肪相对含量增加,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。与此同时,高脂饮食组大鼠骨骼肌PKB蛋白表达有下降趋势,但与正常对照组比较,差异无统计学意义(P=0.071);骨骼肌GLUT4和脂肪组织PPARγ蛋白表达量减少,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2药物干预4周后大鼠各项指标的变化:2.1血糖、血脂、血清胰岛素及葡萄糖输注率的变化。实验结束时,高脂对照组大鼠血清TC、TG、FBG、FINS均显著升高,GIR明显下降,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。经药物干预,罗格列酮组TC、TG、FBG、FINS均下降,GIR明显升高,与高脂对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。银杏叶各组上述指标改善程度不同,与高脂对照组比较,银杏叶1组TC、TG下降,差异有统计学意义(P<0.05);FBG、FINS、GIR变化不明显(P>0.05)。银杏叶2、3组TC、TG、FBG、FINS下降,GIR升高,与高脂对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。与银杏叶1组比较,银杏叶2、3组TC、FINS下降(P<0.01);银杏叶3组GIR升高(P<0.05)。但银杏叶2、3组与罗格列酮组TC、TG、FBG、FINS、GIR等指标差异均无统计学意义(P>0.05)。2.2药物干预后OGTT结果。高脂对照组大鼠0′及糖负荷后60′、120′血糖及曲线下面积(AUC)均升高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。与高脂对照组比较,银杏叶1组0′、120′血糖降低(P<0.05或P<0.01);银杏叶2、3组、罗格列酮组0′、120′血糖,AUC下降,差异有统计学意义(P<0.01)。银杏叶2组60′血糖较罗格列酮组及银杏叶1组下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);银杏叶3组120′血糖低于银杏叶1组(P<0.05)。且高脂对照组大鼠存在糖负荷后血糖高峰延迟,120′血糖为测定范围内最高值。其它各组高峰均在30′或60′。2.3药物干预后血清瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子α、游离脂肪酸含量的测定。高脂对照组大鼠表现为血清游离脂肪酸、肿瘤坏死因子α升高,内脏脂肪相对含量增加,脂联素水平下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。血清瘦素有升高趋势,但与正常对照组比较,差异无统计学意义(P=0.054)。药物干预使血清游离脂肪酸、肿瘤坏死因子α下降,脂联素水平升高。各药物干预组上述指标与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。其中在银杏叶3组,游离脂肪酸水平下降最明显,与银杏叶1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。银杏叶2、3组与罗格列酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。银杏叶3组瘦素水平最低,且与银杏叶1、2组、罗格列酮组比较差异有统计学意义(P<0.05)。银杏叶2、3组血清脂联素浓度升高明显,与银杏叶1组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。银杏叶1组、银杏叶3组、罗格列酮组间血清肿瘤坏死因子α水平差异有统计学意义(P>0.05)。银杏叶3组血清肿瘤坏死因子α明显低于银杏叶2组,差异有统计学意义(P<0.05)。药物干预使内脏脂肪相对含量减少,与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),银杏叶2、3组内脏脂肪相对含量低于罗格列酮组及银杏叶1组,差异有统计学意义(P<0.01),但银杏叶2、3组之间内脏脂肪相对含量无差异(P>0.05)。2.4血清瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子α、游离脂肪酸、内脏脂肪相对含量与GIR的相关分析。血清肿瘤坏死因子α、游离脂肪酸、内脏脂肪相对含量与GIR呈显著负相关(P<0.01或P<0.05)。血清脂联素与GIR呈显著正相关(P<0.01)。血清瘦素与GIR相关性不显著(P=0.13).2.5药物干预后大鼠骨骼肌组织PKB、GLUT4及脂肪组织PPARγ表达情况。2.5.1骨骼肌PKB表达情况:高脂对照组大鼠骨骼肌PKB蛋白表达下降,但与正常对照组比较,差异无统计学意义(P=0.063);PKB mRNA表达下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量银杏叶提取物及罗格列酮干预使高脂喂养大鼠骨骼肌PKB蛋白水平和mRNA表达不同程度增加,与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);低剂量的银杏叶提取物干预对大鼠骨骼肌PKB表达无显著影响。银杏叶2、3组与罗格列酮组大鼠骨骼肌PKB蛋白水平和mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),但与银杏叶1组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2.5.2骨骼肌GLUT4表达情况:高脂对照组骨骼肌GLUT4蛋白和mRNA表达均明显下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。药物干预使骨骼肌下调表达的GLUT4不同程度增加(P<0.05或P<0.01)。其中银杏叶2、3组和罗格列酮组大鼠骨骼肌GLUT4蛋白水平升高,与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);银杏叶1组骨骼肌GLUT4蛋白表达也是增加的,与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。银杏叶2组、银杏叶3组大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA的表达增加,与高脂对照组、银杏叶1组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。银杏叶1组、罗格列酮组大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA的表达与高脂对照组比较增加不显著(P>0.05)。2.5.3脂肪组织PPARγ的表达情况:高脂对照组大鼠脂肪组织PPARγ蛋白表达有下降趋势,但与正常对照组比较,差异无统计学意义(P=0.055)。药物干预使脂肪组织PPARγ表达不同程度增加。其中银杏叶2组、银杏叶3组、罗格列酮组大鼠脂肪组织PPARγ表达升高显著,三组之间PPARγ表达水平无差异(P>0.05),与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。银杏叶1组脂肪组织PPARγ蛋白表达无明显增加,与高脂对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);且与银杏叶3组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。高脂对照组PPARγmRNA表达显著下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。银杏叶2、3组,罗格列酮组大鼠脂肪组织PPARγmRNA表达均明显增加,与高脂对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),但三组之间差异无统计学意义。银杏叶3组与银杏叶1组比较,脂肪组织PPARγmRNA表达情况差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1高脂喂养大鼠血清总胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸、空腹血糖、空腹血清胰岛素不同程度升高,葡萄糖输注率降低,口服葡萄糖耐量实验证实高脂喂养大鼠对糖负荷的处理能力下降。2银杏叶提取物可以降低高脂饮食大鼠血清胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸,增加葡萄糖输注率,调节糖耐量,改善高脂饮食大鼠的胰岛素敏感性。3高脂饮食大鼠血清肿瘤坏死因子α、瘦素浓度升高,脂联素水平降低,内脏脂肪相对含量增加。葡萄糖输注率与血清游离脂肪酸、肿瘤坏死因子α水平、内脏脂肪相对含量呈显著负相关,与血清脂联素浓度呈显著正相关,与血清瘦素水平相关性不明显。4高脂喂养使大鼠骨骼肌组织PKB、脂肪组织PPARγ蛋白水平呈下降趋势。骨骼肌GLUT4蛋白及mRNA的表达下降,脂肪组织PPARγmRNA表达下降。5银杏叶提取物可以调节脂肪因子肿瘤坏死因子α、瘦素、脂联素的分泌,调节骨骼肌PKB、GLUT4和脂肪组织PPARγmRNA的表达并呈现出一定的剂量相关性,即中、高剂量银杏叶提取物干预对胰岛素敏感性及相关指标的改善作用优于低剂量组。