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在人类神经网络中,神经元之间的信号传输是由神经递质介导的,而神经递质的释放是由突触囊泡融合调控的。在突触囊泡融合过程中,syntaxin-1A、VAMP2和SNAP-25这三个可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SolubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE）蛋白通过它们的SNARE区域相互结合形成SNARE复合物,在许多蛋白及因子共同调控下,突触囊泡与突触前膜融合,最终完成神经递质的释放。膜融合的调控过程极其复杂,目前仍有一些调控蛋白的机制尚未解释清楚。由于真核细胞中膜融合机制的高度保守性,酵母细胞与人体细胞共享SNARE膜融合机制,其中syntaxin-1A、VAMP2和SNAP-25的直系同源蛋白Sso1/2、Snc1/2和Sec9在酵母胞外分泌过程中形成SNARE复合物并调控这个过程。人类神经递质释放受到抑制会引起各种神经性疾病,而酵母的胞外分泌过程受到抑制会影响酵母的生长。基于酵母基因操作简单、生长周期短等优点,可以将人类的神经元膜融合过程重构到酵母中,在酵母中研究神经元SNARE膜融合机制。肉毒神经毒素（Botulinum neurotoxins,BoNTs）通过裂解SNARE蛋白来抑制神经递质释放而syntaxin-1结合蛋白tomosyn通过与SNAP-25以及syntaxin-1A形成SNARE复合体来抑制神经递质释放。本研究在之前的基础上进一步完善人源化酵母模型,利用该模型在酵母中研究SNARE膜融合机制并进一步在酵母中构建BoNT/C活性分析系统以及tomosyn功能分析系统。本论文的主要研究成果如下:（1）分析Sso1/STX1A不能替换Sso1和Sso2功能的原因。Sso1/STX1A是Sso1和syntaxin-1A的嵌合体蛋白,其中Sso1的SNARE区域被syntaxin-1A的相应区域所取代,但是Sso1/STX1A不能替代酵母细胞中Sso1和Sso2的功能。通过筛选发现当在Habc结构域中引入某些突变时,Sso1/STX1A嵌合体蛋白也能替代Sso1和Sso2的功能,与之前的研究SNARE区域中引入突变的结果类似。荧光结果显示Sso1/STX1A在酵母细胞中的功能不相容性可能归因于其在ER中的积累。根据这一推测,进一步验证发现具有功能的Sso1/STX1A突变体（D133V和A220E突变）可以从ER释放出来。（2）Syntaxin家族不同SNARE蛋白的特性分析。首先验证了Sec9或者Snc1过表达情况下Sso1/STX1A以及Sso1/STX1AA220E/D133V的ER定位是由于它们在ER中形成异常的SNARE复合体;随后通过荧光定位以及IP实验分析Sso1以及syntaxin-1A的SNARE区域的特性差异发现syntaxin-1A的SNARE区域更容易在ER中形成异常的SNARE复合体;通过IP实验分析Sso1以及syntaxin-1A的自身相互作用发现syntaxin-1A通过其SNARE区域发生自身结合而Sso1则不能,这进一步说明了Sso1和syntaxin-1A蛋白具备不同特性;最后,荧光定位及IP结果说明syntaxin-1A通过与Munc-18结合来维持紧密的封闭状态,这更进一步说明syntaxin-1A和Sso1的SNARE区域具备不同的特征。（3）5-FOA药物筛选获得Sso1/STX1A能替换Sso1和Sso2功能的酵母突变菌株。首先,通过5-FOA药物筛选获得一株Sso1/STX1A重组蛋白功能回补的sso1?sso2?双敲除酵母菌株;随后分离该菌株中的有效突变基因并通过酵母全基因组测序以及数据库比对发现候选突变基因GFA1上的G373突变成D;通过分析GFA1基因的G373D对Sso1/STX1A重组蛋白定位的影响以及GFA1代谢途径的研究初步提出了G373D突变回补该菌株生长的机制;进一步验证了人的直系同源蛋白GFPT1相对应位点的突变在酵母中与GFA1的G373D突变具有相同的功能,这为GFPT1在人类神经性疾病及其他相关疾病的研究提供了一种思路。（4）利用人源化酵母模型分析BoNT/C轻链活性。首先验证了BoNT/C轻链表达不会对野生型酵母的生长造成影响;随后发现BoNT/C轻链可以通过降解Sso1/STX1AD133V突变体来影响表达Sso1/STX1AD133V突变体的sso1Δsso2Δ双敲除酵母的生长,因此,可以通过监测酵母的生长来分析BoNT/C的活性;最后,利用酵母生长表型的差异分析不同Sso1/STX1A重组蛋白对BoNT/C的敏感性差异,发现底物被BoNT/C轻链识别和降解是由SNARE前半部分α-exosite中213-215位的HDM三个氨基酸以及降解识别位点K253V254所介导的。（5）建立一个用于tomosyn功能分析的酵母模型。首先验证了过表达tomosyn不影响野生型酵母的生长而能抑制表达Sso1/STX1A突变体的sso1Δsso2Δ双敲除酵母菌株的生长;通过酵母生长表型差异进一步分析不同的Sso1/STX1A突变体在酵母中与tomosyn的结合,发现SNARE区域前面的12个氨基酸有助于syntaxin-1A与tomosyn的结合,即syntaxin-1A的整个α螺旋区域都是结合tomosyn所必须的。因此,可以通过监测人源化酵母的生长来表征tomosyn的功能。