天然橡胶是巴西橡胶树乳管系统经甲酸戊羟（MVA）途径合成的高分子顺式异戊二烯（1,4cis-polyisoprene）。巴西橡胶树因为具有产胶量大、产胶时间长和天然橡胶易收集等优点,而成为大规模商业化天然橡胶来源。多年来,研究者们对合成途径中关键酶基因的克隆和酶学特征展开了大量研究,这些研究虽然极大的推动了对天然橡胶生物合成途径的认识,但是天然橡胶生物合成分子调控机制仍不清楚。因此,阐明天然橡胶生物合成分子调控机制逐渐成为重大理论问题。14-3-3蛋白是真核生物的中心调控蛋白,通过与靶蛋白的相互作用调控物质代谢、信号转导、染色质功能、离子转运和囊泡运输。在植物中,14-3-3蛋白涉及调控物质代谢、生物和非生物胁迫、植物生长发育、激素途径和对光的响应等。相关报道表明14-3-3调控植物次生代谢物的生物合成。我们前期实验结果表明,14-3-3蛋白在高产和低橡胶树品种中差异表达,推测14-3-3参与调控了天然橡胶的生物合成,但具体调控机制还不明确。本研究从巴西橡胶树中克隆了 10个14-3-3蛋白基因（HbGF4a-j）,阅读框碱基数在759-795个之间。进化分析表明,这十个基因分为两大类,HbGF14j、i、c h、b属于非ε类,均含有4个外显子;HbGF14a、d、e、g、f属于ε类,均含有7个外显子。推导的氨基酸序列高度保守,10个基因编码的氨基酸数目在253-264之间,10个蛋白的蛋白分子量在28.522-29.784 kDa间,10个蛋白的等电点在4.60-4.84之间。采用荧光定量PCR研究了这10个14-3-3蛋白基因在橡胶树各组织间的表达情况,结果表明这10个基因在橡胶树根、茎、叶、花和胶乳中均有表达,HbGF14a、b、c、e、f、g和h在胶乳中有相对较高的表达。JA和ET处理,HbGF14b表达下调。而其他9个基因则呈现不同程度的上调表达。亚细胞定位结果表明,10个蛋白在细胞质和细胞核均有不同程度的分布。为了筛选与在乳管细胞中相对表达量较高的7个14-3-3蛋白相互作用的靶蛋白,我们构建了一个酵母双杂交文库,文库单菌落个数为2.8×106/μl,浓缩文库细胞数为4.72×108/μl,保存文库的滴度为4.92×107cfu/ml,插入片段大小主要分布于500-2000 bp间,插入重组率为96%。以HbGF14a、b、c、e、f、g和h为诱饵蛋白,从文库中共筛选出81个候选蛋白。这些蛋白按功能分成胁迫相关蛋白、热休克蛋白、氧化应激蛋白、转录相关、蛋白/DNA/RNA结合蛋白、ATP酶、信号蛋白、蛋白代谢相关蛋白、碳水化合物代谢、胶乳代谢相关和未知蛋白十一个大类。结果中出现一个C3HC4型锌指蛋白转录因子（命名为HbRZF）和一个小橡胶粒子蛋白HbSRPP。采用酵母双杂交、BiFC和Pull-Down试验方法,证实了 HbGF14a与HbRZF之间存在蛋白之间的相互作用。进一步证实了 HbGF14a与HbRZF的相互作用发生在HbGF14a的7-8螺旋;HbRZF与HbGF14a互作发生在HbRZF的C端的RKVTCP motif。酵母单杂交证实,HbRZF与橡胶合成关键酶-橡胶转移酶的启动子（pHbHRT）存在蛋白质-DNA的结合。双荧光素酶瞬时表达体系实验结果表明HbRZF负调控pHbHRT,而HbGF14a解除HbRZF对pHbHbRT的负调控。采用酵母双杂交、BiFC和Pull-Down,证实HbGF14c与HbSRPP存在蛋白质间的相互作用,HbGF14c对HbSRPP的调控作用还有待进一步的研究。本研究系统的分析了巴西橡胶树HbGF14蛋白基因家族。证实HbGF14蛋白参与天然橡胶的生物合成。证明HbRZF负调控启动子pHbHbRT的活性。发现HbGF14a蛋白通过与转录因子HbRZF相互作用调节天然橡胶关键基因表达的调控模式。证明HbGF14c与HbSRPP发生蛋白质间的相互作用。这些结果有助于我们进一步认识乳管细胞中天然橡胶的生物合成,为采用分子生物学手段改良高产橡胶树品种提供理论基础。