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本研究以徐薯55-2为材料,首先建立其胚性悬浮细胞系;然后以该悬浮细胞系为受体,建立了农杆菌介导的甘薯悬浮细胞系遗传转化体系;在此基础上,将具有淀粉结合功能的淀粉结合结构域SBD2转入甘薯55-2中,进而分析了SBD2的表达和转基因甘薯淀粉的理化性质。结果如下:
1、农杆菌介导的徐薯55-2悬浮细胞系遗传转化条件的确立
将徐薯55-2茎尖接种到MS+2mg/L2,4-D固体培养基上诱导得到胚性愈伤,胚性愈伤在MS+2mg/L2,4-D液体培养基中培养80-120d后形成再生能力强的悬浮细胞系。利用建立的悬浮细胞系为材料,对根癌农杆菌EHA105介导的甘薯遗传转化进行了系统的研究。该菌株所携带的pTCK303质粒上含有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS),通过统计农杆菌侵染后GUS基因表达百分率得到如下结果:将达到对数生长的根癌农杆菌菌液稀释至为OD600nm=0.6-1.0,侵染继代培养3-4d后的胚性悬浮细胞8-12min,之后共培养3-4d达到最高的表达效率。其中采用0.45mol/L甘露醇作为渗透压处理悬浮细胞40-80min及在共培养培养基中添加200μmol/L乙酰丁香酮均能提高转化效率。
2、抗生素选择压力的确定
由于不同甘薯品种悬浮细胞对抗生素的敏感程度不同,我们首先研究不同浓度卡那霉素对徐薯55-2胚性愈伤的存活及增殖的影响,结果表明:适宜的卡那霉素浓度为10mg/L。头孢霉素、羧苄青霉素及万古霉素是遗传转化中常用的去除农杆菌的抗菌素,我们比较三种抗生素对徐薯55-2胚性愈伤增殖和体细胞胚的分化的影响,研究表明:最合适的抗生素为头孢霉素,其对徐薯55-2的增殖和体细胞胚的分化影响比较小,并且其抑制农杆菌的效果比较好,适宜的浓度为200mg/L。
3、遗传转化与植株再生
利用上述建立的转化体系,研究了淀粉结合结构域(SBD2)基因的遗传转化,根癌农杆菌EHA105携带质粒pBIN19,该质粒携带SBD2和NPTII基因。将根癌农杆菌EHA105侵染后的胚性悬浮细胞转移到含有2.0 mg/L2,4-D、10 mg/L Kan和200mg/L Cefo的MS液体培养基中进行选择培养,经过4-8周的选择培养,获得抗Kan的愈伤组织。将得到的Kan抗性愈伤组织转移到添加200 mg/L Cefo、10 mg/L Kan、1.0 mg/L ABA和1.0 mg/LGA3的MS固体培养基上,Kan抗性愈伤组织分化,共产生35个抗性芽,将这些芽转移到含10 mg/L Kan的MS基本培养基上,获得了12株再生植株.PCR和Southern检测结果表明,12株再生植株是转基因植株,斑点杂交证实SBD2在转基因甘薯淀粉中得到表达,在不同转基因株系中表达量有差异.
4、转基因甘薯淀粉理化特性分析
通过光学显微镜(LM)和电镜(SEM)对转基因植株以及对照植株块根中的淀粉粒进行理化性质的比较分析。观察发现,转基因淀粉颗粒形态与对照有差异,在转基因淀粉粒中出现许多小淀粉颗粒聚集、成簇存在的,而在对照淀粉中没有发现这种情况。但是,在淀粉颗粒大小透光率、膨胀势、表观直链淀粉含量、凝胶性质、糊化特性及热特性等理化性质方面,转基因淀粉与对照淀粉没有差异.由此可见,SBD2的导入没有改变除淀粉粒形态以外的其它淀粉理化性质,是非常好的淀粉-效应蛋白的连接锚。本实验的结论为以后利用SBD2作为“锚’对淀粉结构进行改良奠定基础。