近年来,随着生活和饮食习惯的改变,全世界糖尿病病人的增长率高速增加,每年约增加700万糖尿病病人。预计到2025年,全球将会有3亿人患有糖尿病。据统计,糖尿病病人在中国超过九千四百万,已成为糖尿病的高发国家。糖尿病对患者心血管系统的损害是糖尿病患者器官损害的主要表现之一,约有3/4糖尿病患者存在心血管系统疾病的风险,因此糖尿病引起的心血管并发症是糖尿病患者致残和死亡的主要原因。尽管预防和治疗糖尿病心肌损害的方法和策略有多种,但都未显著减少糖尿病患者心血管并发症的发生率和死亡率,因此糖尿病心肌病的防治道路仍然漫长且艰巨。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是独立于高血压、冠心病和心脏瓣膜疾病,由糖代谢紊乱引起以心脏结构和功能障碍为主要病理改变的一种心肌病变。早期表现为左心室僵硬,舒张功能和顺应性降低。随着时间延长及病变加重,患者逐渐出现心脏收缩功能受损,及其引起的呼吸困难等症状,最终发展为充血性心力衰竭。糖代谢异常是糖尿病心肌病的始发因素,但其诱发糖尿病心肌损害的具体分子机制仍不清楚,因此探寻糖尿病心肌损害的病理新机制尤为重要,对寻找治疗靶点,维持心脏功能,阻止心力衰竭,减少猝死的发生有着重要的临床指导意义。心肌细胞内受损线粒体蓄积已成为多种心脏病变的共同病理生理机制,因此对心肌细胞内受损线粒体及时、有效的清除已成为心脏病变研究领域的热点。Pink1/Pakrin通路通过介导线粒体自噬参与对心肌细胞内受损线粒体的选择性清除,在维持心肌细胞稳态,改善心功能方面具有重要作用。但该通路是否参与糖尿病心肌病的发生仍不明确。因此我们本研究的目的如下:①在糖尿病心肌病形成过程中,心肌中Pink1/Parkin介导的线粒体自噬水平是否发生改变,如何改变?②如果Pink1/Parkin通路发生改变,该通路变化是糖尿病心肌病发生的伴随现象,还是引起糖尿病心肌病的原因。③Pink1/Parkin通路是否通过调节线粒体自噬参与糖尿病心肌病的发生。【目的】1.构建糖尿病心肌病模型,观察Pink1/Parkin通路及线粒体自噬水平在糖尿病心肌病中的变化。2.利用Parkin基因敲除小鼠和培养原代心肌细胞,在在体和离体水平明确Pink1/Parkin通路是否参与糖尿病心肌损害的发生。3.原代心肌细胞过表达Parkin后给予自噬抑制剂3-MA,证实Pink1/Parkin通路通过调节线粒体自噬参与糖尿病心肌病的发生。【研究方法】1.挑选40只8周龄,体重18~22g的C57雄性小鼠,随机分为2组:正常组(Control)和糖尿病心肌病组(DM)。2.DM组小鼠每天以50 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ),连续注射5天,检测空腹血糖大于11.1mmol/L确定为糖尿病造模成功。造模成功后,继续饲养8周,建立糖尿病心肌病模型。超声检测小鼠心脏功能。3.HE和MASSON染色观察心肌组织的病理改变。4.TUNEL法检测心肌组织中心肌细胞的凋亡。5.透射电镜下观察小鼠心肌组织中线粒体的形态和自噬体的形成。6.Western-blot检测心肌组织中Pink1、Parkin、Mfn1、Mfn2、Nix、Beclin1、P62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白水平。7.将C57和Parkin-/-小鼠随机分为四组:正常C57小鼠组(WT),糖尿病C57小鼠组(WT-STZ),正常Parkin基因敲除小鼠组(Parkin)和糖尿病Parkin基因敲除小鼠组(Parkin-STZ)。糖尿病模型建成后,继续饲养8周。8周末,超声检测各组小鼠的心功能。8.培养原代心肌细胞,随机分为以下6组:A:阴性对照组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Lac Z;B:正常Parkin过表达组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Parkin;C:正常Parkin过表达+3-MA干预组(5.5 mmol/L葡萄糖):Con+Parkin+3-MA;D:高糖阴性对照组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Lac Z;E:高糖Parkin过表达组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Parkin;F:高糖Parkin过表达+3-MA干预组(33 mmol/L葡萄糖):HG+Parkin+3-MA。9.TUNEL法检测原代心肌细胞的凋亡。10.透射电镜下观察原代心肌细胞中线粒体的形态和自噬体的形成。11.荧光显微镜观察心肌细胞中GFP-LC3阳性的细胞数。12.Western-blot检测心肌细胞中Pink1、Parkin、Mfn1、Mfn2、Drp1、Nix、Beclin1、P62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的蛋白水平。【研究结果】1.糖尿病心肌病小鼠的心脏收缩功能较正常小鼠显著下降,心肌细胞凋亡增加。糖尿病心肌病小鼠的心肌纤维增粗、断裂,排列紊乱,但心肌纤维化不明显。糖尿病心肌病小鼠心肌组织中,线粒体排列紊乱,线粒体发生肿胀,线粒体嵴断裂,部分线粒体发生空泡化。与非糖尿病小鼠相比,糖尿病心肌病小鼠心肌组织中自噬体形成减少,线粒体自噬水平降低。2.与正常小鼠相比,糖尿病心肌病小鼠心肌中Parkin、Mfn2、Nix和Beclin1的表达显著下降,Mfn1和Opa1的表达明显增多,而Pink1和Drp1的水平未发生改变。3.正常Parkin-/-小鼠的心脏收缩功能和正常C57小鼠相比,无明显改变。与正常Parkin-/-小鼠相比,糖尿病Parkin-/-小鼠的心脏收缩功能显著降低,并较糖尿病C57小鼠的心脏收缩功能进一步降低。4.高糖作用48h后,心肌细胞的凋亡显著增加;Parkin过表达可以显著减少高糖引起的心肌细胞凋亡,而自噬抑制剂3-MA可以完全抵消Parkin过表达对心肌的保护作用,使心肌细胞的凋亡进一步增多。5.高糖下,心肌细胞内线粒体的体积增大,线粒体嵴模糊、断裂。部分线粒体发生空泡化。细胞中未见典型自噬体的形成。而Parkin过表达组心肌细胞内线粒体体积较小,线粒体嵴清晰可见,排列有序,线粒体内未见空泡。细胞内可见典型自噬体的形成。给予3-MA处理后,心肌细胞线粒体肿胀明显,线粒体嵴消失,大量线粒体发生空泡化。心肌细胞中自噬体消失。6.和正常组相比,高糖组心肌细胞中含有GFP-LC3的荧光阳性细胞数减少;Parkin过表达可以显著增强心肌细胞中GFP-LC3的荧光阳性细胞数。给予3-MA处理后,心肌细胞内含有GFP-LC3的荧光阳性细胞数显著减少。7.Western结果显示:和正常组相比,高糖组心肌细胞内Parkin、Mfn2、Nix和Beclin1的表达显著下降,Mfn1和Opa1的表达明显增多。Parkin过表达可以上调高糖作用下Mfn2、Nix和Beclin1的蛋白水平,下调Mfn1的蛋白水平,但对Pink1和Opa1的表达无影响。高糖作用下,心肌细胞内P62水平升高,而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降。和高糖相比,Parkin过表达组P62水平显著下降,而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高。给予3-MA处理后,Parkin过表达组心肌细胞中的线粒体自噬水平显著被抑制。【结论】通过本实验,我们发现糖尿病导致心肌损害,并首次证实糖尿病引起心肌组织中Pink1/Pakrin介导的线粒体自噬水平下降。我们随后在动物和细胞水平进一步阐明Pink/Pakrin介导的线粒体自噬水平下降是糖尿病心肌损害发生的重要分子机制,为预防和治疗糖尿病心肌病提供了新的靶点及重要的理论依据。