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研究背景：肝脏是人体能量转换、消化、排泄、免疫和解毒等过程的重要器官。肝脏疾病是临床常见的多发病，病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化以及原发性肝癌等极大地影响着人类的健康。我国是肝病的重灾区，约有1.2亿乙肝病毒携带者和1000万例丙肝感染者，有研究表明近80%的原发性肝癌都是由病毒性肝炎引起[1]。目前临床肝病的治疗手段包括外科手术、肝移植术和药物治疗等[2]。药物作为重要的治疗策略，其目的主要是到达病变部位、清除致病因子、修复受损的肝细胞。然而目前大多数肝病治疗药物由于肝脏分布少、药代动力学性质差、毒副作用大等缺点，应用受到了很大的限制。因此，探索肝病治疗的有效方法和策略是目前亟需解决的重大难题[3]。肝靶向给药系统(Hepatic targeted drug delivery systems, HTDDS)是一种可以缓释和控释药物的新型策略，能够将药物有效地递送到肝脏的病变部位，最大程度地发挥药物的治疗效果，降低毒副作用，减少给药次数和用药量，提高了药物的治疗指数、局部浓度和治疗效果，对肝病的治疗具有积极的推动作用，是近年来肝病靶向治疗领域研究的热门[4]。HTDDS可分为主动型和被动型两种，被动型一般是采用生物相容性好、毒性低的聚合材料装载药物，利用体循环代谢中的“增强渗透保留”效应(Enhancedpermeation and retention effect, EPR)和肝脏网状内皮系统的吞噬摄取作用发挥靶向传递的功能。主动型是对载体进行一定的靶向修饰，定向地将药物传递到特定的组织和细胞，常见的模式是利用配体-受体或抗原-抗体的特异性结合发挥作用。研究内容：随着对肝脏组织结构认识地加深，人类不断发现肝脏细胞新的靶点，为肝病的靶向治疗提供了更多新的作用位点。运用质谱分析加双重亲和纯化的技术，我国科学家成功揭示了钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(Sodium Taurocholate CotransportingPolypeptide, NTCP)是HBV和HDV的功能性受体，所用的靶向探针是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)表面抗原PreS1中的一段多肽[5]。HBV是嗜肝类DNA毒科中的一员，其外膜蛋白的preS1段在HBV与肝细胞特异性结合中必不可少，其中与肝细胞特异性结合位点位于第2-48氨基酸肽段中。文献报道：进行乙酰化和豆蔻酰化修饰的pre-S1特殊肽段可成功阻断HBV对人类原代肝细胞(primary human hepatocytes，PHH)、树鼩原代肝细胞(primary tupaia hepatocytes，PTH)和经过诱导分化的HepRG细胞的感染。HBVpreS1的第9-21位氨基酸是具有结合阻断能力的高度保守序列，豆蔻酰化修饰的HBVpreS1/2-21myr是有效阻断抑制的最短多肽，其序列为myr-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-NH2。这提示我们HBVpreS1是与肝细胞表面受体NTCP特异性结合的配体序列，利用其受体与配体特异性结合作用，可以设计出HBVpreS1/2-21myr介导，肝细胞表面NTCP受体靶向的新型肝靶向给药系统。研究方法：课题的总体设计为以HBVpreS1/2-21myr为靶向介质，以长效循环脂质体(longcirculating liposomes,LCL)为药物载体，荧光素钠(Fluorescein Sodium，FS)作为荧光模式评价药物，采用乙醇注入法制备肝细胞NTCP受体靶向的新型药物递送系统HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL。首先，采用微波多肽固相合成法合成HBVpreS1多肽(2-21Aa)，序列为NH2-GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP-COOH，利用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)、质谱(Mass Spectrometry，MS)和离子肼质谱(Ion Trap MassSpectrometry，ITMS)对多肽产物进行表征，进一步进行乙酰化和豆蔻酰化修饰得到多肽HBVpreS1/2-21myr。然后分别进行异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光标记和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Mal)的磷脂基团修饰，荧光标记的多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC用于多肽靶向性的验证，磷脂基团修饰的多肽产物HBVpreS1/2-21myr-PEG2000-DSPE，将作为脂质体合成的原料与大豆磷脂、胆固醇等脂质体配方成分混合一起，加热并制备脂质体。其次，制备的荧光素钠靶向脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL和普通脂质体FS-LCL运用透射电子显微镜(Transimission electron microscope，TEM)观察纳米脂质体的超微形态结构，激光粒度仪测量脂质体粒径大小和分布，HPLC检测脂质体的包封率，并对高压均质机处理的影响和脂质体稳定性做了进一步的研究。此外，通过RT-PCR和质粒转染的方法构建能够稳定表达NTCP的HepG2-NTCP、LO2-NTCP和HEK293-NTCP细胞，原代肝细胞活体分离的方法获得树鼩原代肝细胞和大鼠原代肝细胞。这些细胞将作为体外细胞靶向评价模型分析荧光多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC和荧光素钠靶向脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL的肝脏靶向性。将荧光多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC与上述细胞模型孵育培养，以流式细胞术和共聚焦显微镜进行观察和检测，RT-PCR的方法检测转染的细胞中NTCP的表达，从蛋白水平和mRNA水平验证细胞模型构建成功。最后，将包裹有荧光素钠的靶向纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL、对照的普通脂质体组FS-LCL和荧光素钠水溶液FS，分别与上述细胞进行孵育培养，以流式细胞技术和激光共聚焦显微镜分析纳米脂质体的肝靶向性。研究结果：(1)固相法合成的HBVpreS1多肽(2-21Aa)纯度较高，合成工艺简单、操作方便，合成效率高；高效液相色谱、质谱和离子肼质谱表征结果提示合成的多肽产物与设计的多肽序列GTNLSVPNPLGFFPDHQLDP分子量大小一致，序列吻合；(2)成功进行了FITC的荧光标记和DSPE-PEG2000-Mal的磷脂基团修饰；(3)荧光标记的多肽HBVpreS1/2-21myr-FITC具有肝细胞NTCP受体靶向性；(4)制备的荧光素钠靶向纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL粒径大小合适，平均值为(94.09±9.2) nm；脂质体包封率较高为(89.32±1.02)%；制备工艺操作方便、简单高效，稳定性好；(5)构建的HepG2-NTCP、LO2-NTCP、HEK293-NTCP细胞和活体分离培养的树鼩原代肝细胞可作为HBVpreS1/2-21myr和HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL的体外靶向评价模型；(6)制备的荧光素钠靶向纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL具有肝细胞NTCP受体靶向性。研究结论：通过本实验，我们证实了HBVpreS1/2-21myr与表达有NTCP的HepG2-NTCP、LO2-NTCP和HEK293-NTCP细胞，以及树鼩的原代肝细胞有明显地特异性结合，HBVpreS1/2-21myr修饰的纳米脂质体HBVpreS1/2-21myr-FS-LCL与对照组相比，通过NTCP与HBVpreS1的受体-配体结合作用，可以高效地递送更多的荧光素钠进入细胞，实现靶向药物传递系统的靶向递送功能，可以做为肝脏靶向给药新策略，为肝病的特异性治疗提供了新的途径和方法。