目的:先天性甲状腺功能减低症（congenital hypothyroidism,CH）是婴幼儿最常见的一种代谢性疾病,若患儿未得到明确诊断和及时治疗,则在儿童期会出现不可逆的生长发育落后和智力缺陷,CH常见的类型是甲状腺发育不全（thyroid dysgenesis,TD）。遗传因素在TD的发病中起着很重要的作用,但目前仅有为数不多的TD致病基因被发现。本研究在前期初步筛选NKX6-2为TD的新候选致病基因的基础上,采用靶向测序技术对该候选致病基因进行遗传学放大验证,以确定NKX6-2是否为TD的致病基因,随后对发现的4个NKX6-2杂合错义突变进行致病机理研究,明确NKX6-2错义突变导致其功能改变引起TD的分子致病机理。方法:前期选取290例CH患儿进行外显子重测序,经高级生物信息学分析和文献回顾后初步确定NKX6-2可能是与甲状腺发育相关的候选基因之一。本研究选取479名TD患者,采用靶向测序技术对初步确定的新TD候选致病基因NKX6-2进行遗传学验证,结合前期发现的NKX6-2基因突变研究基因型和表型的关系,随后对前期工作中发现的4个杂合错义突变c.32T>C/p.L11P,c.280G>A/p.G94R,c.609G>T/p.W203C和c.782C>T/p.S261L进行功能学研究。首先构建NKX6-2野生型真核表达载体,利用点突变试剂盒诱导突变型真核表达载体。将野生型和突变型NKX6-2真核表达载体分别转染人正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1细胞,24h和48h后分别提取总RNA和总蛋白,用荧光定量PCR（q PCR）检测甲状腺细胞NKX6-2 mRNA的表达,用Western blotting检测NKX6-2蛋白的表达。细胞增殖实验（CCK-8）、划痕实验和transwell实验检测野生型和突变型NKX6-2对甲状腺细胞增殖和迁移的影响,用双荧光素酶报告基因实验检测野生型和突变型NKX6-2对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:采用靶向测序技术对479名TD患者的NKX6-2基因进行测序,结果与China MAP的对照（N=10588）进行比较,费希尔精确检验P=1.958e-08。在5例TD患者（2例甲状腺异位,3例甲状腺发育不良）中检测到4个不同的突变c.196C>T/p.R66W,c.436G>C/p.G146R,c.58C>T/p.H20Y和c.354G>A/p.W118X。Poly Phen-2,SIFT,Mutation Taster和PROVEAN软件预测这4个突变均为有害突变,H20,R66和G146位于蛋白保守区域,W118位于非保守区域。结合前期工作中发现的1个NKX6-2纯合错义突变c.388C>A/p.P130T和4个不同的杂合错义突变c.32T>C/p.L11P,c.280G>A/p.G94R,c.609G>T/p.W203C和c.782C>T/p.S261L,综合分析表明没有发现NKX6-2突变热点或清楚的基因型和表型的关系。对前期发现的4个杂合错义突变进行细胞功能学研究表明空载组和WT组或WT组分别和突变组L11P,G94R,W203C,S261L比较,在Nthy-ori 3-1细胞的增殖和迁移上均没有统计学意义。L11P组在NKX6-2的表达水平上与WT组无明显差异,但荧光素酶活性明显下降;G94R组NKX6-2 mRNA和蛋白的表达量减少,但荧光素酶活性与WT组比较无统计学意义;W203C和S261L组NKX6-2 mRNA的表达量相对于WT组没有改变,但是蛋白水平却显著下降,荧光素酶活性与WT组相比无明显统计学差异。结论:本研究揭示了NKX6-2可能是TD的新候选致病基因,并报道了TD患者中发现的NKX6-2突变,但在我们的研究中没有发现明确的基因型和表型的关系。对4个NKX6-2杂合错义突变进行细胞功能学研究表明NKX6-2基因在甲状腺发育过程中可能不参与甲状腺细胞的增殖和迁移,虽然这4个不同的突变对NKX6-2的表达或者转录激活能力造成了影响,但仍需进一步的实验验证这4个突变体对甲状腺发育的其他生理过程如细胞分化和凋亡等的影响。