【摘 要】
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目的:神经元参与并介导了痛觉过敏,但是目前单纯的以神经元作为药物靶点的治疗过程中出现了镇痛效果十分有限的现象,这表明或许有非神经元细胞的机制参与了病理性疼痛的形成。和神经元一样,中枢神经系统中的小胶质细胞也能表达许多神经递质和神经介质,从而参与痛觉过敏的形成。但目前还未见有研究指出吗啡可以诱导小胶质细胞的不同活化状态,并参与痛觉过敏的形成。在本研究中,我们旨在探讨吗啡对小胶质细胞极化状态的影响以及
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目的:神经元参与并介导了痛觉过敏,但是目前单纯的以神经元作为药物靶点的治疗过程中出现了镇痛效果十分有限的现象,这表明或许有非神经元细胞的机制参与了病理性疼痛的形成。和神经元一样,中枢神经系统中的小胶质细胞也能表达许多神经递质和神经介质,从而参与痛觉过敏的形成。但目前还未见有研究指出吗啡可以诱导小胶质细胞的不同活化状态,并参与痛觉过敏的形成。在本研究中,我们旨在探讨吗啡对小胶质细胞极化状态的影响以及M2型小胶质细胞参与痛觉过敏形成的机制。方法:1.体外实验中,检测不同浓度吗啡刺激诱导HAPI小胶质细胞极化状态的变化情况。PBS（0.1M）、不同浓度的吗啡（0.1,1,10,100μM）和IL-4（20μg/ml）孵育HAPI小胶质细胞24h。实验细胞分为正常对照组（不做处理）,vehicle组（PBS）、不同浓度的吗啡（0.1,1,10,100μM）组和IL-4组。用Western Blot首先测定小胶质细胞激活标记物CD11b蛋白表达情况,再测定各组细胞中M1型和M2型小胶质细胞标记蛋白表达水平的变化情况。2.体外实验中,检测高浓度（100μM）和低浓度（0.1μM）吗啡刺激诱导HAPI小胶质细胞中MOR-P2X4R-BDNF信号通路的表达情况。首先,分别用诱导小胶质细胞主要活化为M2型的低浓度吗啡（0.1μM）,诱导小胶质细胞主要活化为M1型的高浓度吗啡（100μM）,以及0.1μM吗啡μ阿片受体选择性拮抗剂（β-氟那曲胺盐酸盐）混合液孵育HAPI小胶质细胞24h,通过Western Blot和RT-qPCR测定各组小胶质细胞信号通路下游P2X4R与BDNF的表达量。3.鞘内注入经低浓度吗啡孵育的HAPI小胶质细胞,观测大鼠疼痛行为学变化。我们将大鼠注射单纯的PBS溶液（0.1M）,以及用PBS（0.1M）,吗啡（0.1μM）和IL-4（20μg/ml）孵育小胶质细胞HAPI 24h,收取细胞直接鞘内注入正常大鼠（每只2000-5000个/10μl）,再分别用ZH-YLS-3E电子压痛仪、ZH-YLS-6B智能热板仪测量大鼠的机械痛阈值（PWMT）和热痛阈值（TWL）。结果:1.随着吗啡浓度的升高,吗啡诱导小胶质细胞活化为M1型标志蛋白（CD86,iNOS）表达量逐渐增加,而活化为M2标志蛋白（CD206,Arg-1）表达量逐渐下降。其中,与正常对照组相比,0.1μM吗啡组,CD206和Arg-1蛋白表达显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）,而CD86和iNOS的表达差异无统计学意义（P>0.05）。与IL-4组相比,低浓度吗啡（0.1μM）组CD206和Arg-1蛋白表达有所下降,差异具有统计学意义（P<0.01）,而CD86和iNOS的表达有所增加,差异具有统计学意义（P>0.05）。高浓度吗啡（100μM）组与正常对照组相比,CD86和iNOS的蛋白表达水平显著增加,差异具有统计学意义（P<0.01）,而CD206和Arg-1蛋白的表达差异无统计学意义（P>0.05）。2.Western Blot结果显示,与正常对照组相比,vehicle组MOR、P2X4R和BDNF的表达水平没有变化,差异无统计学意义（P>0.05）。与高浓度吗啡组相比,低浓度吗啡组MOR、P2X4R和BDNF蛋白表达水升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,与盐酸β-氟那曲胺盐酸盐（MOR拮抗剂）预孵育1h后,再用低浓度吗啡处理的HAPI小胶质细胞的MOR、P2X4R和BDNF蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR结果显示,低浓度吗啡组MOR、P2X4R和BDNF m RNA表达水平均高于高浓度吗啡组,差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,与盐酸β-氟那曲胺盐酸盐预孵育1h后,低浓度吗啡处理的HAPI小胶质细胞的MOR、P2X4R和BDNF的m RNA表达水平显著降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.将经低浓度吗啡（0.1μM）孵育的小胶质细胞HAPI鞘内注入正常大鼠鞘内,大鼠的机械痛阈和热痛阈出现明显降低现象（P<0.01）。结论:吗啡诱导的小胶质细胞M2表型中MOR-P2X4R-BDNF信号通路表达上调,并且M2型小胶质细胞可能参与痛觉过敏的形成。这或许为痛觉过敏的机制研究和治疗提供新的思路。
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