肺癌是我国和世界死亡率最高的恶性肿瘤,对社会和经济发展造成了沉重的负担。起病隐匿和病情进展迅速常使肺癌患者得不到有效治疗,通过开展早期诊断和早期预防对提高肺癌的生存率尤为重要。苯并[a]芘（benzo[a]pyrene,B[a]P）作为致癌性最高的多环芳烃类（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）有机物,可以诱导DNA损伤和基因组改变。B[a]P进入机体后,在体内细胞色素P4501A代谢酶的作用下代谢为终致癌物二氢二醇环氧苯并[a]芘（benzo[a]pyrene-diol-epoxide,BPDE）,后者与血浆白蛋白结合形成BPDE-白蛋白（benzo[a]pyrene diol epoxide-albumin,BPDEAlb）加合物运输到全身。因此,通过检测血浆中BPDE-Alb加合物水平可以评估机体B[a]P的内暴露剂量。长期暴露于B[a]P可使肺癌发生风险增加。锌（zinc,Zn）作为人体的必需微量元素,参与调控DNA损伤和修复、细胞增殖和分化、蛋白酶的激活或抑制等多种生物过程,并在抗氧化和免疫调节中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,血浆Zn水平升高与肺癌风险降低相关,然而Zn对B[a]P致肺癌效应的影响却少有报道。DNA甲基化是主要的表观遗传学修饰,可以通过调控癌基因或抑癌基因的表达促进肺癌的发生。研究表明,B[a]P暴露可以引起基因组总体或特定位点甲基化水平的改变,DNA甲基化可能参与了B[a]P暴露致肺癌发生的过程。多种表观遗传酶中都有锌结合位点,Zn在维持这些酶的活性中具有重要作用,因此,Zn水平可能影响DNA甲基化的水平或其与环境暴露的关联。然而Zn是否能影响B[a]P暴露相关的表观遗传学变化与肺癌风险的关联,目前相关证据十分有限。基于以上研究背景,本论文旨在通过人群流行病学研究探索Zn在B[a]P致肺癌发生中的作用。首先,在东风-同济队列人群中设计肺癌的病例-队列研究,检测研究人群血浆中Zn和BPDE-Alb加合物水平,分析血浆Zn对BPDE-Alb加合物与肺癌发生风险关联性的修饰作用。然后,通过全基因组DNA甲基化芯片检测肺癌病例-队列人群的外周血全基因组DNA甲基化水平,分析其与血浆BPDE-Alb加合物的相关性,并在此基础上探讨血浆Zn对BPDE-Alb加合物相关DNA甲基化与肺癌发生风险关联性的修饰作用。最后通过肺癌患者的肺癌组织和癌旁组织全基因组甲基化芯片检测数据、m RNA测序数据,TCGA在线公共数据库基因表达数据分析DNA甲基化水平与相应基因表达水平的相关性,以及DNA甲基化注释基因在肺癌组织和癌旁组织中的表达差异性。研究内容主要分为以下两个部分:第一部分锌对苯并[a]芘与肺癌发生风险关联性影响的病例-队列研究目的:在肺癌病例-队列研究人群中探讨血浆Zn对BPDE-Alb加合物与肺癌风险关联性的效应修饰作用。方法:以东风-同济队列2013年招募的38 295名研究对象为基础,排除心电图异常、中风、冠心病、癌症患者和医保号及血液样本缺失者,在剩下的24 415人中以5.8%的抽样率,按年龄和性别分层,随机抽取1399人作为子队列人群,并纳入24 415人截止到2018年12月31日新发的359例肺癌患者（其中16例位于子队列中）,共同组成肺癌病例-队列研究人群。通过问卷调查获取研究对象基本信息,分别采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和电感耦合等离子体质谱仪（inductively coupled plasma–massspectrometry,ICP-MS）检测研究对象2013年基线血浆中BPDE-Alb加合物和Zn的浓度,采用加权Cox比例风险回归模型分析BPDE-Alb加合物和Zn与肺癌发生风险的关联性,并用限制性立方样条（restricted cubic spline,RCS）曲线拟合BPDE-Alb加合物和Zn与肺癌风险的剂量-反应关系,模型中校正年龄、性别、体质指数（body mass index,BMI）、吸烟和饮酒状态、受教育水平、规律性体育锻炼和实验批次。进一步分析人群一般特征,如年龄、性别、吸烟和饮酒状态与BPDE-Alb加合物、Zn对肺癌风险的交互和联合作用。此外,依据子队列人群Zn水平的第33.3%和66.7%分位数将研究人群分为低、中、高Zn水平组,评估在不同Zn水平人群中BPDE-Alb加合物和肺癌风险的关联,并分析Zn对BPDE-Alb加合物和肺癌风险关联性的效应修饰作用。结果:自然对数（natural logarithm,ln）转换的基线血浆BPDE-Alb加合物每升高一个标准差（standard deviation,SD）,肺癌发病风险增加55%[风险比（hazard ratio,HR）和95%置信区间（confidence interval,CI）=1.55（1.32,1.82）];ln转换的基线血浆Zn每升高一个SD,肺癌发病风险降低21%[HR（95%CI）=0.79（0.68,0.92）]。RCS分析结果表明,BPDE-Alb加合物和Zn均与肺癌风险呈线性关联（P均＜0.05）。饮酒对BPDE-Alb加合物与肺癌风险的关联性具有显著的效应修饰作用（P交互=0.013）。年龄＞65岁、吸烟与高水平的BPDE-Alb加合物在增加肺癌风险上具有联合作用[HR（95%CI）=3.52（2.33,5.31）和2.70（1.66,4.37）,Ptrend均＜0.001];而年龄≤65岁、不吸烟与高水平的Zn在降低肺癌发生风险上具有联合作用[HR（95%CI）分别为0.28（0.18,0.42）和0.34（0.21,0.53）,Ptrend均＜0.001]。按照子队列人群血浆Zn的第33.3%和66.7%分位数将研究对象分为三组（T1、T2、T3组,分别对应低、中、高Zn水平组）,分析发现在血浆Zn的低水平（T1）、中水平（T2）组中,血浆BPDE-Alb加合物与肺癌风险呈显著的正向关联[HR（95%CI）分别为2.36（1.65,3.38）和1.61（1.20,2.15）],而在血浆Zn的高水平（T3）组中,BPDE-Alb加合物与肺癌发生风险的关联性不再显著[HR（95%CI）=1.29（0.92,1.82）,P=0.140],血浆Zn和BPDE-Alb加合物对肺癌发生风险具有显著的负向交互作用（P交互=0.021）。结论:随着基线血浆BPDE-Alb加合物水平的升高,肺癌发生风险显著增加,而随着基线血浆Zn水平的升高,肺癌发生风险显著降低。高水平的Zn可降低BPDE-Alb加合物对肺癌的危险效应,为Zn在B[a]P致肺癌发生中的保护作用提供初步证据。第二部分锌对苯并[a]芘与肺癌发生风险关联性影响的表观遗传学研究目的:从全基因组水平发现与血浆BPDE-Alb加合物相关的DNA甲基化位点,进一步探索BPDE-Alb加合物相关DNA甲基化水平与肺癌发病风险的关联性,并评估血浆Zn水平对上述关联的效应修饰作用。方法:本部分基于肺癌病例-队列研究人群,采用Illumina Infinium Human Methylation EPIC Bead Chip（EPIC芯片）测定研究对象全血DNA甲基化水平。在子队列人群中采用多元线性回归模型进行BPDE-Alb加合物与DNA甲基化的表观基因组关联性分析,协变量包括年龄、性别、BMI、吸烟和饮酒状态、全血预测细胞比例以及Smart SVA计算的所有替代变量。参考既往文献选择关联性P＜1.0×10-5的Cp Gs位点作为BPDE-Alb加合物相关Cp Gs,通过基因功能注释、GO通路富集分析、DNA共甲基化模式等生信分析方法探讨上述Cp Gs注释基因的潜在生物学功能。进而在肺癌病例-队列研究人群中,采用加权Cox比例风险回归模型分析上述Cp Gs位点与肺癌发生风险的关联性。对筛选出的与肺癌风险显著相关的Cp Gs位点,探讨其甲基化水平与血浆Zn水平的关联性。依据子队列人群血浆Zn的第33.3%和66.7%分位数将研究对象分为三组（T1、T2、T3组,分别对应低、中、高Zn水平组）,评估在不同Zn水平人群中上述Cp Gs甲基化水平与BPDE-Alb加合物和肺癌发生风险的关联性,并进一步分析Zn和Cp Gs甲基化水平对肺癌风险的交互作用。最后,通过32例肺癌患者的肺癌组织和癌旁组织全基因组EPIC芯片检测数据、m RNA测序数据,以及癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）公共数据库中1037例肺癌组织和108例癌旁组织基因表达数据,分析Cp Gs甲基化水平与注释基因表达水平的关联性,并比较DNA甲基化注释基因在肺癌和癌旁组织中的表达差异性。结果:表观基因组关联性分析发现,外周血中29个CpGs甲基化水平与血浆BPDEAlb加合物的关联性P＜1.0×10-5,其中NLRC5基因的cg07839457、B2M基因的cg05475649和LOC100996291基因的cg19748455甲基化与BPDE-Alb加合物具有全基因组显著性关联（FDR＜0.05）。BPDE-Alb加合物相关的Cp Gs注释基因主要参与细胞凋亡、免疫应答、维持蛋白酶活性和肿瘤调控等生物学过程。在上述29个Cp Gs位点中,随着LOC100996291基因cg19748455、TMEM129和TACC3基因cg02089348和C1QL2基因cg17021907甲基化水平的升高,肺癌发生风险显著降低,而随着IRS2基因cg01156012、AKAP1基因cg05407682、XRCC3基因cg12798040和FAM135A基因cg24518943甲基化水平的升高,肺癌发生风险显著升高（P＜1.72×10-3,0.05/29Cp Gs）。血浆Zn与AKAP1基因cg05407682甲基化水平呈显著的负向关联[β（SE）=-0.136（0.071）]。在低Zn组人群中,高BPDE-Alb加合物与外周血中cg19748455和cg02089348低甲基化显著负相关[β（SE）分别为-1.312（0.257）和-0.514（0.181）],而与cg05407682、cg12798040和cg24518943甲基化水平显著正相关[β（SE）分别为1.163（0.261）,0.719（0.232）和0.437（0.196）];而在高Zn组人群中上述关联不再显著（P均＞0.05）。随着血浆Zn水平的增加（由T1、T2至T3组）,AKAP1基因cg05407682和IRS2基因cg01156012甲基化水平与肺癌风险的关联性效应呈现降低的趋势[cg01156012:HR（95%CI）分别为1.88（1.40,2.52）、1.67（1.18,2.36）和1.41（1.00,2.00）;cg05407682:HR（95%CI）分别为1.58（1.23,2.03）、1.38（1.04,1.83）和0.92（0.68,1.26）],Zn对cg05407682甲基化水平与肺癌风险关联性具有显著的负向修饰作用（P交互=0.012）。在32例肺癌患者的癌旁组织中发现随着cg05407682甲基化水平的提高,AKAP1基因m RNA表达水平显著增加（r=0.341,P=0.043）,且AKAP1基因表达水平在肺癌组织中显著高于癌旁组织（P＜0.001）。结论:本研究发现了29个与血浆BPDE-Alb加合物显著相关的CpGs位点,这些CpGs注释基因主要参与细胞凋亡、免疫应答、肿瘤调控等生物学过程。其中LOC100996291基因cg19748455、TMEM129和TACC3基因cg02089348及C1QL2基因cg17021907高甲基化可显著降低肺癌的发生风险,而IRS2基因cg01156012、AKAP1基因cg05407682、XRCC3基因cg12798040和FAM135A基因cg24518943高甲基化可显著提高肺癌的发生风险。高水平的血浆Zn与AKAP1基因cg05407682低甲基化相关,且随着血浆Zn水平的升高,AKAP1基因cg05407682甲基化水平与肺癌发生的关联性效应逐渐降低,Zn对cg05407682甲基化与肺癌风险的关联性具有显著的负向效应修饰作用。进一步的组织学分析显示cg05407682高甲基化与AKAP1基因高表达相关,且AKAP1基因表达水平在肺癌组织中显著高于癌旁组织。本部分研究从表观遗传学角度阐述了Zn在B[a]P致肺癌发生中的保护作用。综上所述,本研究发现高水平的Zn可降低BPDE-Alb加合物对肺癌风险的危险效应,Zn对BPDE-Alb加合物相关的AKAP1基因cg05407682甲基化水平与肺癌风险的关联性具有显著的负向效应修饰作用,表明Zn可能通过影响B[a]P相关的表观遗传学改变进而发挥其对B[a]P致癌的保护作用。