论文部分内容阅读
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，并与黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤（MALT）及胃癌的发生密切相关，H．pylori感染严重危及人类的健康，因此，如何有效控制H．pylori感染亟需解决，但至今还没有一种单一的抗生素可根除H．pylori感染，二联抗生素疗法对H．pylori的根除率也不高，目前，临床抗H．pylori治疗多采用在质子泵抑制剂（PPI）或胶体铋剂的基础上加两种抗生素的三联疗法，常用抗生素包括甲硝唑（Metronidazole，MTZ）、克拉霉素（Clarithiomycin，CLA）、阿莫西林（Amoxicilin，AMX）。然而，近年来随着抗生素的广泛应用，H．pylori对抗生素产生耐药性呈上升趋势，耐药性的产生是根除H．pylori失败的重要原因。
甲硝唑（Metronidazole，MTZ）是H．pylori三联及四联疗法中常用的抗生素，属于硝基咪唑类药物，其本身为一种无抑菌活性的药物前体，需在细胞内被硝基还原酶激活后才能发挥灭菌作用。由于MTz在人体内具有活性高、稳定性强及价格便宜等优点，因而成为根除H．pylori感染的首选药物之一，然而，MTZ的耐药率在几种治疗H．pylori的抗生素中居高，H．pylori对甲硝唑的耐药降低了包含有MTZ治疗方案的疗效，从而成为根治H．pylori失败的重要原因。目前主要认为：H．pylori通过基因突变或基因表达调控，使作用于细菌的硝基还原酶含量降低，从而阻止或抑制MTZ转化为使细菌致死的还原产物，最终导致细菌对药物的耐受。大多数研究推断甲硝唑耐药可能与rdxA、frxA、fdxB基因突变密切相关，它们分别编码氧不敏感的NADPH硝基还原酶、NADPH黄素氧化还原酶和铁氧还原蛋白类似物。但也有研究者发现这些基因在部分敏感株和耐药株中的表达一致，这提示MTZ耐药株的形成过程中可能存在其它基因的参与，因此有必要进一步研究H．pylori对MTZ耐药的新机制。
研究H．pylori对甲硝唑的耐药机制实际上就是揭示药物作用细菌后信号转导机制。基于基因组学技术的研究存在局限性，即使捕获到细菌内mRNA的信息仍不能代表基因产物蛋白质的最终功能，这就需要我们从生命活动的执行者蛋白质入手，研究药物干预后蛋白质种类及数量的变化。目前蛋白质组学研究较为流行的技术体系是应用双向凝胶电泳分离蛋白质、质谱分析鉴定所分离的蛋白质，应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。幽门螺杆菌两个菌株（H．pylori26695和H．pyloriJ99）的全基因组序列测序已经完成，利用现有的生物信息学资源，本研究旨在通过高通量的蛋白质组学技术了解幽门螺杆菌在MTZ作用下由敏感株转化为耐药株的蛋白质表达模式变化，为初步阐明幽门螺杆菌耐药性的机制奠定基础。据此，我们主要做了以下工作：
1、幽门螺杆菌甲硝唑耐药株的体外诱导和鉴定
体外培养幽门螺杆菌26695（H．pylori26695），并利用药物浓度连续倍增的方法建立H．pylori26695甲硝唑耐药株，分别测定用药前后甲硝唑对H．pylori26695的最低抑制浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC），MIC值变化≧32倍时被确定为诱导出对抗生素耐药的菌株，为保证抗生素耐药株的稳定性，连续培养细菌5代后进行回复实验，再测定其MIC值，最后进行PCR扩增rdxA基因并测序检测其是否发生突变。本研究结果证明我们成功诱导出稳定的H．pylori26695甲硝唑耐药株，其对甲硝唑的耐受浓度为敏感株的256倍，经回复实验耐药株的MIC值前后保持一致，rdxA基因测序结果显示3个位点发生插入突变，该工作为研究幽门螺杆菌对MTZ耐药机制提供了实验模型。
2、幽门螺杆菌甲硝唑敏感株与耐药株蛋白质组双向电泳图谱的构建
分别收集H．pylori26695敏感株与耐药株，提取细菌总蛋白，应用等电聚焦电泳（IEF）将菌体蛋白质在不同pH梯度进行分离，然后用SDS—PAGE电泳技术根据分子量的不同在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离；通过双向凝胶电泳（2—DE）技术分离菌体蛋白，蛋白质显色使用银染法，用扫描仪获取蛋白质双向凝胶电泳图谱，利用ImageMastet2DElite软件进行图像分析，寻找敏感株与耐药株的差异性蛋白质斑点。结果发现在H．pylori耐药株中有55个蛋白斑点表达差异显著。
3、幽门螺杆菌甲硝唑敏感株与耐药株的差异表达蛋白的质谱鉴定
利用基质辅助激光解吸电离—飞行时间质谱仪（MALDI—TOF—TOF）对表达差异性的蛋白质点进行MAlDI—TOF—TOF质谱分析，共得到24个蛋白质点的可靠信息，23个蛋白质点在耐药株中的表达升高，1个蛋白质点在耐药株中表达降低。通过网络蛋白质数据库（http：//www．matrixscience．com and http：//www．expasy．ch/tools/peptident．htm）搜索对比后，这些蛋白质分别涉及细胞生长、合成与代谢以及压力反应等生物学功能。本研究结果提示H．pylori26695甲硝唑耐药株的形成涉及到多种蛋白质，初步表明幽门螺杆菌可能通过多种途径在甲硝唑环境下存活，甲硝唑以复杂的机制影响细菌生物学功能的不同过程，例如与尿素酶和氢化酶合成密切相关的ureG和hypB，热休克蛋白家族的dnaK和groEL及参与菌体细胞分裂过程的ftsZ均发生明显变化。