研究背景：　　探讨HT的临床特征和发病机理有助于为临床提供HT的诊断依据　　目前国内外对HT的临床诊断和研究较少，尤其是国内仅有HT的个案报道，对HT的研究目前几乎空白。一方面由于HT是罕见疾病，发病率低，病例数少；另一方面，临床医师对该类疾病缺乏认识，常被漏诊或误诊为ITP或其他血小板减少症，且明确诊断需要依靠基因诊断，但目前基因诊断尚不能广泛开展；另外，严重的HT病例未来得及明确诊断，可能于出生后不久就已死亡；能存活的HT病例临床症状较轻，极少影响患者的生活质量，容易被忽视。因此，通过临床观察、追踪和实验研究探索该类型血小板减少症的临床特征和发病机理有利于为临床提供HT的诊断依据。　　巨核细胞产生血小板的过程及其调控　　巨核细胞的生成由骨髓多潜能造血干细胞首先分化为早期共同髓系祖细胞 CMP。随后分化为早期巨核-红系祖细胞MEP，具有双潜能分化能力的MEP可发育为高度增殖的早期BFU-MK或更成熟的CFU-MK。巨核细胞内Caspase系统的激活导致细胞凋亡，引起血小板的产生。　　巨核细胞和血小板生成的过程受转录因子、细胞因子和趋化因子的作用。其中，促血小板生成素（Thrombopietin，TPO）是血小板生成过程中最主要的调控因子，其受体C-MPL由原癌基因c-mpl编码，在巨核细胞、血小板和造血前体细胞表面均有表达[21]，TPO通过与造血细胞膜上C-MPL结合而激活信号转导通路，促进巨核细胞的增殖、分化和成熟及血小板的形成。其他多效性生长因子如GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-11，SCF和EPO等均可单独或与TPO协同作用刺激巨核细胞的生长发育。TGF-β1，PF4和IL-4可抑制巨核细胞发育。核转录因子GATA1通过影响JAK2激酶和STAT1的活性调控巨核细胞早期定向分化的发育过程。　　巨核细胞产生血小板过程中任一环节异常均可导致血小板减少　　复习文献，HT主要累及巨核系祖细胞，引起 HT患者血小板较少的原因主要是巨核细胞生成障碍导致血小板生成减少，巨核细胞产生血小板过程中任一环节出现异常均可能导致血小板减少。如位于Xp11.22-23的WAS基因突变，可导致WAS；c-mpl基因突变致C-MPL表达和功能改变可引起CAMT；先天性无巨核细胞性血小板减少伴桡尺骨骨性连接(congenital amegakaryocytic thrombocytopenia with radio-ulnar synostosis，CTRUS)是由HOX基因突变所致；具有AML倾向的家族性血小板疾病（familial platelet disorder with predisposition to acute myelogenous leukemia，FPD/AML）是由位于21q22.1上的RUNX1基因发生突变所致；血小板膜蛋白复合物 GPIb-IX-V相关性疾病（GPIb-Ⅸ-Ⅴ-RD）是由编码 GPIb-α、GPIb-β和GPⅨ的基因发生异常所致；非肌性肌球蛋白重链9(MYH9)相关性疾病（MYH9-RD）由MYH9基因突变所致；X连锁性血小板减少伴地中海贫血（X-linked thrombocytopenia with thalassemia，XLTT)由位于Xp11.23的GATA-1基因突变引起；Paris-Trousseau综合征（PTS）又称Jacobsen综合征（Jacobsens syndrome，JS）由染色体11q23.3–q24.1片段缺失所致；蒙特利尔血小板综合征（Montreal platelet syndrome，MPS）患者的血小板中钙蛋白酶的水解活性明显降低，导致血小板自发聚集，从而使血小板数量减少。　　发病机制不明的HT　　目前TARS确切的发病机制和遗传方式仍不明确；现研究认为蒙特利尔血小板综合征（Montreal platelet syndrome，MPS）患者的血小板中钙蛋白酶的水解活性明显降低，导致血小板自发聚集，从而使血小板数量减少，凝血功能降低，但致病基因仍不明确。　　课题的提出　　综上所述，目前国内外对HT的诊断和实验研究较欠缺，某些HT发病机制仍不明确，巨核细胞和血小板生成的每一环节异常均可能导致该类疾病。本研究拟对HT患儿进行临床观察、追踪，在细胞水平、基因水平、蛋白质水平、染色体和血小板活性的多个层面进行研究，以期探讨HT的临床特征和发病机理，为临床诊断提供指导。　　研究目的：　　通过临床观察、追踪和相关实验研究，观察中国儿童HT临床特征，摸索HT的实验诊断方法，探讨HT的生理病理特点和发病机制，以期充实HT的临床和实验研究资料，提高其诊断和鉴别诊断水平。　　研究内容：　　1．临床观察和追踪　　包括患儿的病史、体征、实验室和影像学检查结果。定期随访观察患者体格发育、肢体功能、智力发育、内分泌代谢发育情况，并检查有无其他畸形。　　2．发病机理研究　　包括细胞水平、基因水平、蛋白质水平、染色体和血小板活性的研究。　　研究方法：　　1．研究对象的选择和标本采集处理选择临床拟诊HT病例、确诊ITP病例和正常对照病例。每一病例分别采集外周血和骨髓标本：①分离外周血，获取富含血小板血浆；②抽提外周血MNC的基因组DNA；③分离并获得血清；④提取骨髓MNC。　　2．临床观察①病史：询问其家族史，父母是否近亲结婚，母亲妊娠情况（有无感染、用药等病史），出生情况（体重、身长、窒息抢救、出血、用药等）；②体格检查：病例体格发育指标、皮肤黏膜出血情况、表浅淋巴结大小、心肺情况、肝脾大小等；③实验室检查：血常规、出凝血功能、骨髓象、内分泌代谢功能。　　3．造血祖细胞集落培养采用甲基纤维素半固体培养方法，对各研究对象骨髓造血祖细胞进行培养，观察红系、粒系和巨核系造血集落的情况并进行计数。　　4．相关基因的扩增和测序定性PCR扩增c-mpl、HoxA10、TGF-β2、Ets-1基因，并对各基因扩增产物进行测序，分析其是否存在突变、缺失或插入等。　　5．血清细胞因子检测利用ELISA方法检测血清IL-11、TNF-α、TGF-β1和TPO水平，对HT患儿、ITP患儿和正常对照者结果进行比较，分析其与疾病的关系；建立正常儿童血清TPO水平参考范围。　　6．血小板表面C-MPL水平检测利用FCM检测CD110+细胞的表达率和平均荧光强度，分析HT患儿和ITP患儿C-MPL的表达水平，并探讨正常儿童血小板表面C-MPL水平。　　7．血小板信号转导通路JAK/STAT检测以TPO刺激血小板，利用Western blot检测HT患儿、ITP患儿和正常对照者血小板JAK/STAT通路蛋白JAK2、STAT5和STAT3及其磷酸化蛋白的表达变化。　　8．血小板活性及对TPO反应性检测以ADP、TRAP或协同TPO刺激血小板，利用FCM检测HT患儿、ITP患儿和正常对照者血小板表面CD62p+的表达水平的变化。　　研究结果：　　1．HT临床特征5例HT患儿起病较早，于婴幼儿期即发病，临床特征除了血小板减少引起的出血点、瘀点、瘀斑等症状外，还包括疾病本身特有的一些特征如桡骨缺如、湿疹，且均存在各种脏器和骨骼畸形。　　2．骨髓祖细胞造血集落培养情况4例HT患儿CFU-MK集落较正常明显减少，ITP则无明显差异；TARS患儿CFU-GM明显增多，2例CAMT患儿CFU-GM明显减少；而CFU-E和BFU-E均较正常对照者减少。WAS患儿、ITP患儿与正常对照者相比，CFU-GM、CFU-E和BFU-E无明显差异。　　3．相关基因测序结果5例HT患儿、3例ITP患儿和9例正常对照者的c-mpl、HoxA10、TGF-β2、Ets-1基因序列未发现任何突变、缺失或插入等。　　4．正常儿童血清TPO水平参考范围74例正常儿童血清TPO水平检测，其95％正常参考范围为11.82~488.53pg/ml。　　5．HT患儿血清细胞因子与ITP患儿和正常对照者比较4例HT和3例ITP IL-11和TNF-α水平均在正常范围内，血清TGF-β1水平均低于正常对照者。ITP患儿血清TPO水平为正常对照者的1~2倍；除TARS患儿外，其余3例HT血清TPO水平明显高于正常对照者，为正常对照者的2倍以上。　　6．正常儿童血小板表面C-MPL表达水平40例正常儿童血小板表面C-MPL表达率和平均荧光强度检测，其95%参考范围分别为13.34%±12.27%和1.47~8.98。　　7．HT患儿血小板表面C-MPL表达水平与ITP患儿和正常对照者比较4例HT和3例ITP血小板表面C-MPL表达水平与正常对照者一致。　　8．血小板内JAK/STAT通路蛋白表达情况15份血小板悬液中，未经TPO刺激的血小板均可检测到JAK2、STAT5和STAT3的表达，无p-JAK2、p-STAT5和p-STAT3的表达；经TPO刺激的血小板内JAK2、STAT5和STAT3的表达均较对照组减弱，同时可检测到p-JAK2、p-STAT5和p-STAT3的表达。　　9．血小板活性及对TPO反应性8例正常对照者血小板有活性，且对TPO有反应；TARS患儿血小板活性高于正常对照者，且对TPO几乎无反应；2例CAMT患儿血小板对TPO几乎无反应；WAS患儿血小板活性低于正常对照者，且对TPO反应差；3例ITP患儿血小板活性正常，且血小板对TPO有反应。　　结论：　　1．临床上遇见血小板减少症患者，排除其他可引起血小板减少的其他疾病，伴骨骼等各种畸形等应警惕HT，以免误诊。可早期发现HT。　　2．HT病例血小板减少与巨核细胞或血小板生成障碍有关，且骨髓造血异常主要累及巨核系。　　3．正常儿童血清TPO水平参考范围的建立对儿童血小板减少性疾病的诊断、鉴别诊断、病情评估和转归预测具有一定的指导意义。血清TPO水平明显增加反映骨髓巨核细胞增生减低，检测血清中TPO水平有助于HT和ITP的鉴别诊断。　　4．TGF-β1在HT发病中的作用，可能并非直接抑制巨核细胞的生成，而是通过影响造血内环境的基质细胞干预巨核细胞的生成，具体的机制尚待进一步研究。　　5．正常儿童血小板表面C-MPL表达水平的检测对血小板减少性疾病的诊断、鉴别诊断以及发病机理的探讨具有一定的指导意义。本研究中2例 CAMT患儿为少数不能检出 c-mpl基因突变的患者，血小板表面 C-MPL表达量无异常，可能存在其他遗传机制导致巨核细胞和血小板膜上C-MPL功能异常，从而导致CAMT的发病。　　6．利用Western Blot可直接检测到外周血血小板内 JAK/STAT通路中的相关蛋白JAK2、STAT5和STAT3及其磷酸化蛋白p-JAK2、p-STAT5和p-STAT3等的表达，且经TPO刺激血小板后，正常人血小板内出现p-JAK2、p-STAT5和p-STAT3蛋白表达。　　7．ITP和正常对照者血小板活性正常，且对TPO有反应；TARS患儿血小板活性高于正常对照者；TARS和CAMT患儿对TPO几乎无反应；WAS患儿血小板活性低于正常对照者，且对TPO反应差；血小板激活剂协同TPO检测不能完全反映血小板对TPO反应性。