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实验目的:2型糖尿病（T2D）一直被称为非胰岛素依赖型糖尿病,或以胰岛素抵抗为特征的成人发病糖尿病。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍这两个环节相互影响是促进T2D发生与发展的主要因素。胰岛素是胰岛β细胞分泌的、体内唯一能降血糖的激素。胰岛素信号首先与细胞表面胰岛素受体（IR）结合,并触发信号级联的激活,以调节代谢和细胞生长。酪氨酸磷酸化的IR招募并磷酸化IR底物,随之激活PI3K。PI3K/AKT可通过调控胰岛素相关信号通路影响胰岛β细胞代谢和凋亡,从而影响胰岛素分泌和血糖调节。SNX16是SNX家族的一个独特成员,包含PX结构域和一个卷曲线圈（CC）结构域。PX结构将SNX16定位于内体中,通过与蛋白膜的磷酸肌醇结合,将负载蛋白募集到多种内膜系统上,从而调控负载蛋白的内吞作用及胞内分选。本实验室前期研究发现胰岛β细胞SNX16敲除小鼠代谢功能发生改变,且胰岛β细胞中胰岛素的合成与分泌明显降低。本文旨在利用胰岛β细胞特异性敲除SNX16小鼠探究SNX16对胰岛素的合成与分泌的影响及其发生机制。实验方法:1.构建胰岛β细胞特异性敲除SNX16小鼠:利用SNX16flox/flox小鼠与RIP CRE小鼠交配得到胰岛β细胞特异性敲除SNX16（F/F+）小鼠和不带CRE的（F/F-）小鼠。2.SNX16过表达稳定细胞株的构建及鉴定:利用293T细胞制备慢病毒,感染目的细胞1.1B4,进而经过嘌呤霉素筛选、扩大培养,通过荧光记录初步判断感染效率;利用Western-blot和RT-q PCR技术分析1.1B4稳定细胞株中SNX16的表达情况。3.SNX16对胰岛素合成与分泌影响的检测:取对照组和实验组小鼠腹腔注射生理盐水或葡萄糖溶液,提取胰腺组织,通过免疫组化检测胰岛素的表达情况;提取小鼠胰岛,加不同浓度葡萄糖刺激,通过Elisa试剂盒检测细胞上清胰岛素的分泌情况。4.CCK8增殖能力检测:在96孔板中接种1.1B4稳定细胞株,待细胞贴壁后,分别给予高低糖培养,加入CCK8试剂检测OD值。5.SNX16对IR/PI3K/AKT信号通路的影响:利用分离纯化的小鼠胰岛以及1.1B4稳定细胞株,KRBH溶液饥饿处理,加不同浓度葡萄糖或胰岛素刺激后,提取蛋白质,利用Western-blot检测IR/PI3K/AKT信号通路的相关蛋白。6.SNX16对葡萄糖转运蛋白2的影响:培养1.1B4稳定细胞株,用KRBH溶液饥饿处理两小时,加不同浓度的葡萄糖刺激,提取其蛋白和m RNA,通过Western-blot和RT-q PCR实验分析Glut2的表达情况。7.IR抑制剂对胰岛素合成与分泌的影响:培养1.1B4稳定细胞株,加IR抑制剂。提取细胞全蛋白,通过Western-blot检测IR/PI3K/AKT通路的表达情况;提取细胞RNA,通过RT-q PCR实验分析Glut2、Ins1 m RNA的表达情况;收集细胞上清,通过Elisa试剂盒检测细胞上清胰岛素的分泌情况。8.PI3K抑制剂对胰岛素合成与分泌的影响:培养1.1B4稳定细胞株,加PI3K抑制剂。提取细胞全蛋白,通过Western-blot检测PI3K/AKT通路的表达情况;提取细胞RNA,通过RT-q PCR实验分析Glut2、Ins1 m RNA的表达情况;收集细胞上清,通过Elisa试剂盒检测细胞上清胰岛素的分泌情况。实验结果:1.荧光显微镜观察显示,通过慢病毒感染的SNX16稳定细胞株效率较高;Western-blot和RT-q PCR结果表明SNX16过表达的1.1B4稳定细胞株构建成功。2.免疫组织化学和胰岛素Elisa试剂盒结果显示,在葡萄糖诱导下,胰岛β细胞特异性敲除SNX16后,胰岛素的合成与分泌明显降低。3.在高浓度葡萄糖刺激下,SNX16过表达组细胞的增殖能力明显高于对照组。结果表明,SNX16过表达提高了葡萄糖诱导的胰岛β细胞增殖能力。4.SNX16敲除后,在高浓度葡萄糖刺激下,胰岛组织中p-IR、p-AKT的蛋白表达明显降低;反之,在高糖或短时间胰岛素诱导下,SNX16过表达β细胞中IR、PI3K、AKT的磷酸化水平明显增加。5.在高浓度葡萄糖刺激下,SNX16过表达后明显增加β细胞中Glut2蛋白和m RNA的表达。6.IR抑制剂及PI3K抑制剂明显抑制IR/PI3K/AKT通路,明显降低SNX16过表达后介导的Glut2表达及胰岛素的合成与分泌。结论:SNX16对胰岛素的合成与分泌是必需的,胰岛β细胞特异性敲除SNX16后明显抑制IR/PI3K/AKT信号通路,减少在葡萄糖诱导下的胰岛素合成与分泌。反之,1.1B4细胞系中过表达SNX16后,增强IR/PI3K/AKT信号通路,增加Glut2的表达,促进细胞的活性及增殖能力。我们的结果表明,SNX16在胰岛素合成与分泌中起正向调节作用,SNX16通过IR/PI3K/AKT信号通路调节胰岛β细胞中胰岛素合成和分泌,从而参与机体血糖稳态的调节。