论文部分内容阅读
背景:急性肝损伤是由于药物、酒精、病毒感染等多种原因造成的肝脏功能异常。长期的肝损伤会导致肝纤维化,甚至导致肝细胞癌。因此,控制肝损伤的发生和发展对肝病的治疗具有重大的临床意义。铁死亡是一种非凋亡性、铁依赖性的细胞死亡形式,其发生过程与脂质氢过氧化物积累,膜脂质过氧化有关。铁死亡的出现为急性肝损伤患者的治疗提供了新的方向。前期有研究发现核因子红细胞2相关因子2（NF-E2-related factor 2/Nrf2）在抗铁死亡缓解对乙酰氨基酚造成的肝损伤中发挥重要的作用,也有学者发现自噬做为一种机体的生存保护机制会影响铁死亡和肝损伤的发展。但Nrf2及其诱导的自噬如何协同调控铁死亡进而缓解急性肝损伤的机制目前尚不清楚。目的:探究铁死亡与急性肝损伤的内在联系,明确Nrf2及自噬交互调控铁死亡以缓解急性肝损伤的分子机制,为临床上治疗急性肝损伤提供理论基础与实验依据。方法:1、采用CCl4腹腔注射构建大鼠急性肝损伤模型,萝卜硫素（Sulforaphane/SFN）给药处理后,检测血清或肝组织中ALT、AST、ROS、GSH/GSSG比值、Fe2+、Caspase-3变化;透射电镜观测线粒体形态;HE染色观察大鼠肝脏病理学形态;Western blot实验检测Nrf2、自噬相关蛋白（Microtubule-associated protein1 light chain 3/LC3、SQSTM1/P62）和铁死亡相关蛋白（Solute carrier family 7member 11/SLC7A11、Glutathione peroxidase 4/GPX-4）的表达;免疫组织化学实验检测SLC7A11、GPX-4的表达。2、构建Nrf2基因敲除大鼠,采用CCl4腹腔注射构建大鼠急性肝损伤模型,SFN给药处理后,检测血清或肝组织中ALT、AST、ROS、GSH/GSSG比值、Fe2+、Caspase-3变化;透射电镜观测线粒体形态;HE染色观察大鼠肝脏病理学形态;Western blot实验检测Nrf2、LC3、P62、SLC7A11、GPX-4的表达;免疫组织化学实验检测SLC7A11、GPX-4的表达。3、采用CCl4腹腔注射构建大鼠急性肝损伤模型,SFN、氯喹（Chloroquine/CQ）给药处理后,检测血清或肝组织中ALT、AST、ROS、GSH/GSSG比值、Fe2+、Caspase-3变化;透射电镜观测线粒体形态;HE染色观察大鼠肝脏病理学形态;Western blot实验检测Nrf2、LC3、P62、SLC7A11、GPX-4的表达;免疫组织化学实验检测SLC7A11、GPX-4的表达;免疫荧光实验检测SLC7A11和Lamp2共定位情况。4、采用H2O2构建L02、BRL肝细胞损伤模型,SFN给药处理后,检测细胞存活率、ROS、GSH/GSSG比值、Fe2+、Caspase-3、Lip-ROS的变化,透射电镜观测线粒体形态;选择铁死亡、凋亡、坏死、自噬抑制剂处理后,检测细胞存活率确定细胞死亡模式;Western blot实验检测Nrf2、LC3、P62、SLC7A11、GPX-4的表达;自噬双标腺病毒实验检测自噬流;过表达Nrf2检测自噬标志物的表达情况;染色质免疫共沉淀实验检测Nrf2和Atg5的DNA结合情况。5、采用H2O2造模,在ML385或si Nrf2和SFN处理后,检测细胞存活率、ROS、GSH/GSSG比值、Fe2+、Caspase-3的变化。Western blot实验检测Nrf2、LC3、P62、SLC7A11、GPX-4的表达。6、采用H2O2造模,在CQ或si LC3和SFN处理后,检测细胞存活率、ROS、GSH/GSSG比值、Fe2+、Caspase-3的变化;Western blot实验检测Nrf2、LC3、P62、SLC7A11、GPX-4的表达;激光共聚焦检测SLC7A11与Lamp2共定位情况。7、采用H2O2造模,在CQ、SFN、Compound-C处理后,检测细胞中AMPK、P-AMPK、BECN1、P-BECN1表达情况,免疫共沉淀实验检测P-BECN1和SLC7A11结合情况。结果:1、CCl4诱导的急性肝损伤大鼠肝脏出现明显的气泡样变性、线粒体皱缩,血清中ALT、AST活力明显上升,肝组织中ROS、Fe2+、Caspase-3积累,GSH/GSSG比值下降。与模型组相比,SFN处理可以缓解肝组织的气泡样变性、线粒体损伤,并且可以降低大鼠血清中的ALT、AST的活力,降低大鼠肝组织中ROS、Fe2+、Caspase-3,升高GSH/GSSG比值。Western blot实验检测大鼠肝组织中的蛋白表达,结果表明SFN会激活Nrf2促进自噬,上调SLC7A11和GPX-4的表达。免疫组织化学染色结果表明,与模型组相比,SFN处理后SLC7A11和GPX-4表达上调。2、在Nrf2-/-大鼠中,Nrf2敲除削弱了SFN导致的大鼠血清中的ALT、AST下降及肝组织中ROS、Fe2+、Caspase-3的下降与GSH/GSSG比值的升高。Western blot实验表明,Nrf2敲除削弱了SFN激活的自噬和对SLC7A11、GPX-4的上调。免疫组织化学染色实验表明,Nrf2敲除后SFN对SLC7A11和GPX-4上调作用减弱。3、CQ抑制自噬后削弱了SFN导致的大鼠血清中的ALT、AST下降,及肝组织中ROS、Fe2+、Caspase-3的下降与GSH/GSSG比值的升高。检测大鼠肝组织中蛋白表达,结果表明,CQ并未抑制SFN对Nrf2的激活和对SLC7A11、GPX-4的上调。免疫组织化学染色结果表明CQ处理不会抑制SFN对SLC7A11和GPX-4的上调作用。检测肝组织中SLC7A11在细胞膜和细胞质中的表达发现CQ处理会抑制SLC7A11在细胞膜上的表达,增加SLC7A11在细胞质中的积累。免疫荧光实验发现CQ处理会促进SLC7A11与Lamp2的共定位。4、在细胞实验中,H2O2诱导L02、BRL细胞损伤并出现ROS、Fe2+、Caspase-3、Lip-ROS的积累,GSH/GSSG比值下降。与模型组相比,SFN处理后L02、BRL细胞的存活率上升,ROS、Fe2+、Caspase-3、Lip-ROS降低,GSH/GSSG比值升高。检查L02细胞线粒体形态发现模型组出现明显的线粒体损伤,SFN处理可以缓解线粒体损伤。为确定细胞损伤是否与铁死亡有关,我们选择了铁死亡、凋亡、坏死、自噬抑制剂检测对肝细胞的保护作用。结果表明铁死亡抑制剂可以有效缓解细胞活力下降。Western blot检测L02、BRL细胞中的蛋白表达,发现SFN会激活Nrf2促进自噬,上调SLC7A11和GPX-4的表达。自噬双标腺病毒实验表明SFN会激活自噬。为证明自噬激活与Nrf2表达增加有关,我们构建了Nrf2过表达质粒,瞬时过表达Nrf2后,LC3I向LC3 II转化增多,P62表达降低,表明过表达Nrf2会激活自噬。染色质免疫共沉淀实验结果表明,Nrf2会与Atg5的DNA结合,并且SFN处理后Nrf2与Atg5的DNA结合增多。5、使用Nrf2抑制剂ML385或si Nrf2来验证Nrf2对细胞的保护作用。抑制Nrf2逆转了SFN导致的L02、BRL细胞中ROS、Fe2+、Caspase-3的下降及GSH/GSSG比值的升高。检测L02、BRL细胞蛋白表达发现抑制Nrf2削弱了SFN激活的自噬和对SLC7A11、GPX-4的上调作用。6、CQ或者si LC3抑制自噬削弱了SFN导致的L02、BRL细胞中ROS、Fe2+、Caspase-3的下降及GSH/GSSG比值的升高。在L02、BRL细胞中CQ并未抑制SFN对Nrf2的激活和对SLC7A11、GPX-4的上调。进一步在细胞水平检测细胞对胱氨酸的摄取能力,结果发现CQ会抑制SLC7A11的摄取胱氨酸的能力,检测L02、BRL细胞SLC7A11在细胞膜和细胞质中的表达,发现CQ处理会抑制SLC7A11在细胞膜上的表达,增加SLC7A11在细胞质中的积累。激光共聚焦显示CQ处理会增加L02细胞中SLC7A11和Lamp2的共定位。7、进一步在L02细胞上探寻CQ抑制SLC7A11膜定位的机制,发现CQ可促进AMPK的172位点的磷酸化进而导致BECN1的93位点的磷酸化水平增加。蛋白质免疫共沉淀检测SLC7A11和P-BECN1的结合情况,结果表明,CQ处理后SLC7A11和P-BECN1的结合明显增多。为验证CQ的作用与AMPK和BECN1的磷酸化有关,我们选择了AMPK抑制剂Compound-C,检测AMPK和BECN1的磷酸化水平,结果表明Compound-C显著抑制AMPK和BECN1的磷酸化,蛋白质免疫共沉淀结果表明Compound-C可以减少SLC7A11-P-BECN1复合物的形成。结论:1、急性肝损伤的发生进程和铁死亡相关,可以通过抑制铁死亡缓解CCl4诱导的急性肝损伤。2、SFN可以通过Nrf2和自噬的共同调节来对抗铁死亡并减轻急性肝损伤。3、Nrf2激活可以诱导SLC7A11、GPX-4和自噬相关蛋白的表达。4、Nrf2依赖性自噬是促进SLC7A11膜定位以缓解急性肝损伤的关键步骤。