目的:非经典Wnt配体Wnt5a参与了心血管疾病的发病过程,但关于其在缺血性心肌病以及心肌缺血再灌注损伤中的作用及具体机制尚不清楚。本研究通过建立心肌细胞缺氧/复氧（Hypoxia-reoxygenation,H/R）损伤模型,旨在探讨Wnt5a在心肌细胞H/R损伤中的作用及其机制,以此为临床防治心血管疾病的发生发展提供新的见解和新的靶点。方法:1.H9c2细胞H/R损伤模型的构建。H9c2细胞经缺氧6 h,复氧3 h处理后,CCK-8检测心肌细胞活力;Western blot实验检测心肌细胞Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Cx43以及Wnt5a的蛋白表达;DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平;JC-1探针检测线粒体膜电位;Calcein/AM染色检测细胞间缝隙连接通讯功能;RT-qPCR实验检测Wnt5a m RNA的表达水平。2.探究敲低Wnt5a对心肌细胞H/R损伤的作用。首先,采用siWnt5a转染心肌细胞敲低Wnt5a基因表达。Western blot检测细胞中Wnt5a的蛋白表达。其次,心肌细胞经siWnt5a转染24 h后进行H/R处理,检测各组细胞的细胞活力、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Wnt5a、β-catenin和Cx43的蛋白表达、ROS水平以及线粒体膜电位的变化。3.预测并验证β-catenin靶向调控Cx43。敲低β-catenin后,Western blot和细胞免疫荧光实验观察β-catenin表达分布变化以及对Cx43的影响;生物信息学预测TCF/LEF转录因子家族和Cx43启动子的结合位点,Ch IP实验验证结合并活化Cx43启动子的转录因子;Co IP和免疫共定位实验验证筛选所得的转录因子与β-catenin的结合和共定位情况。4.探究β-catenin与TCF4的相互作用拮抗剂LF3,在经敲低Wnt5a的心肌细胞H/R损伤中的作用。首先,采用Co IP实验筛选LF3的作用浓度和时间;其次,心肌细胞经siWnt5a转染24 h后,进行H/R处理,同时在复氧时给予30μmol/L LF3预处理,同样地检测各组细胞的细胞活力、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Wnt5a、β-catenin和Cx43的蛋白表达、ROS水平以及线粒体膜电位。结果:1.H/R（6 h/3 h）处理H9c2细胞成功建立心肌细胞损伤体外模型。心肌细胞活力显著下降,促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表达显著增多,抗凋亡蛋白Bcl-2和缝隙连接蛋白Cx43的表达显著减少,细胞内ROS水平显著上升,线粒体膜电位显著下降,细胞间缝隙连接通讯功能减弱,而Wnt5a在基因和蛋白表达水平上均显著增多。2.siWnt5a敲低Wnt5a后能够缓解H/R诱导的心肌细胞损伤。结果显示相较于NC+H/R组,siWnt5a+H/R组的心肌细胞活力明显增加,Wnt5a、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达显著减少,Bcl-2和Cx43蛋白表达显著增加,细胞内ROS含量显著减少,线粒体膜电位上升,同时增加其核心响应分子β-catenin在全细胞和细胞核中的表达量。3.敲低β-catenin后,Cx43表达量与之呈现显著的正相关;String数据库显示β-catenin与TCF/LEF转录因子家族均存在结合预测;JASPAR数据库预测TCF/LEF转录因子家族与Cx43启动子存在共计10个结合位点;Ch IP实验验证TCF4是心肌细胞H/R损伤中结合并活化Cx43启动子的关键转录因子;Co IP实验和细胞免疫荧光实验进一步表明TCF4与β-catenin存在显著结合与共定位。4.CoIP实验显示30μmol/L的LF3能够拮抗β-catenin与TCF4相互作用,同时对抗siWnt5a缓解H/R所致心肌细胞损伤的作用。结果显示:相较于DMSO+siWnt5a+H/R组,LF3+siWnt5a+H/R组的心肌细胞的细胞活力显著下降;Bax和cleaved caspase-3的蛋白表达显著增加,而Bcl-2的蛋白表达明显减少;ROS水平显著上升;线粒体膜电位明显下调;此外,Cx43蛋白表达显著减少且细胞间缝隙连接通讯功能减弱,但Wnt5a和β-catenin的蛋白表达无明显变化。结论:1.心肌细胞H/R损伤时Wnt5a高表达,而敲低Wnt5a缓解心肌细胞H/R损伤,同时促进β-catenin核转位以及Cx43表达上调。2.核β-catenin与TCF4形成复合物,并进一步结合活化Cx43基因启动子,促使Cx43表达增加。3.下调Wnt5a通过β-catenin/TCF4级联反应调控效应分子Cx43,增强细胞间缝隙连接通讯功能并缓解心肌细胞H/R损伤。