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口蹄疫俗称“口疮”,主要侵害牛、羊、猪等偶蹄动物,引起口、蹄、乳头等部位会出现水泡形成糜烂。口蹄疫发病率高,传播迅速,制约了畜牧业的发展以及动物和动物产品的国际贸易。近年来,口蹄疫A型从东南亚地区传入我们东亚国家,使我国口蹄疫疫情变得更为严峻,因此,需要一种简便、特异的检测方法对该病进行诊断和监测。本研究通过特异性引物扩增克隆口蹄疫A型病毒的VP1基因,构建表达质粒PET-32a-VP1和pGEX-6p-l-VP1,转入BL21重组菌诱导表达融合蛋白,可溶性分析主要以包涵体形式存在。融合蛋白分别经His和GST柱层析纯化,SDS-PAGE分析蛋白电泳纯度较高,Western blot检测能与口蹄疫A型多克隆抗体特异性结合,而不与O型和Asial型发生反应,表明融合蛋白具有良好的特异性和抗原性。用纯化的融合蛋白PET-32a-VPl免疫6周龄的BALB/c雌性小鼠,经过3次免疫后测定效价均大于1:12800,可用于细胞融合。以纯化的融合蛋白pGEX-6p-1-VP1作为包被抗原进行间接ELISA筛选阳性杂交瘤,经4次细胞亚克隆最终筛选出4株稳定分泌抗口蹄疫A型VP1蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别为1D10、3D12、4E12、5G7;单抗亚型均为IgM和K轻链;上清和腹水效价分别为 1:64、1:16、1:2048、1:512 和 1:2560、1:20480、1:81920、1:1280;单抗的饱和值和相对亲和力分别为1:20、1:40、1:40、1:40 和 1:600、1:600、1:3000、1:300;叠加 ELISA 测定的 AI%值均小于 50%,可能识别同一个抗原表位;阻断ELISA检测4株单抗均能被口蹄疫A型阳性血清阻断。Western blot分析单抗能特异性结合融合蛋白PET-32a-VP1和pGEX-6p-l-VPl,而与BL21菌体蛋白不反应。用纯化的融合蛋白pGEX-6p-l-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625 μg/mL,待检血清稀释度为1:2,单抗最大稀释度为1:400,酶标抗体工作浓度为1:5000,封闭液、待检血清和单抗作用时间分别为60min、60min、45min;阴阳性判断抑制率(PI%)≥30%为阳性。与液相阻断ELISA检测试剂盒比对,符合率为84.8%。试验表明,建立的单抗竞争ELISA检测方法特异性强、稳定性好等优点,可用于口蹄疫A型血清抗体的检测,这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。