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研究背景及目的:脑缺血疾病在临床上主要治疗手段是长期口服抗凝药物或者扩血管药物。其损伤机制主要是氧化损伤、免疫炎症介质释放、神经营养因子的缺失与释放等。针对神经细胞的保护作用,在以往的研究中我们发现芳香小分子物质可以通过嗅觉通路与相应的神经元受体结合,调节相应的神经元细胞。芳香物质经嗅觉通路的给药方式对于脑缺血疾病可能是一种新的防治手段。人类嗅觉与脑功能之间联系密切,嗅觉在一定程度上影响生命本能、学习记忆能力、情绪调节等。嗅觉还与人类的生命活动和生活质量密切相关,嗅觉功能障碍一般会发生在一些重大疾病的初期。嗅觉对大脑皮质、海马、杏仁核、下丘脑、纹状体、梨状皮层、内嗅皮质等脑区神经肽都有调节作用。那么嗅觉通路对脑缺疾病后损伤是否有影响呢?作为嗅觉吸嗅的给药方式相对于口服和注射给药方便安全,高特异性,高敏感度,芳香分子经嗅觉通路给药对于脑缺血疾病能否起到干预作用?其作用机制又是什么?本实验通过大鼠MCAO模型探讨挥发性芳香物质丁香酚,通过嗅觉通路给药方式对于脑缺血后损伤的保护作用及其机制。第一部分MCAO大鼠的模型制备及神经功能评分方法采用大脑中动脉内线栓阻断法制造大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2h后再灌注24h,参照Longa评分标准对大鼠进行神经功能评分,将评分为1~3分的用做实验用鼠,随机分组为丁香酚组和模型组,行假手术成功的大鼠归类为假手术组。共分四组:丁香酚组、模型组、假手术组和正常组。结果神经功能评分1~3分归为模型组和丁香酚组,大鼠有明显的转圈、倾倒、前肢无法伸展的表现。假手术组和正常组神经功能评分为0,无任何异常表现。第二部分丁香酚经嗅觉通路干预MCAO大鼠及神经行为学观察方法丁香酚组给予吸嗅丁香酚3w后,其余组别不作处理正常饲养,各组再次进行神经功能评分后取部分处死,脑切片行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,计算脑梗死容积百分比;通过Morris水迷宫实验检测大鼠脑缺血干预后的学习记忆能力和空间探索能力。结果神经功能评分中丁香酚组与模型组比较,差异有显著性意义(P<0.01);大鼠脑缺血/再灌注后各组均出现白色缺血梗死灶,丁香酚组梗死灶面积/脑切片面积与模型组比较明显降低,差异有显著性意义(P<0.05);水迷宫实验在定位航行实验中,正常组和假手术组逃避潜伏期折线波动基本重合,丁香酚组的逃避潜伏期折线波动居中,明显短于模型组,差异有显著性意义(P<0.05);模型组的逃避潜伏期最长,明显长于正常组和假手术组(P<0.05);在空间探索实验中,正常组与假手术组无差异,模型组每分钟穿越隐匿平台位置的平均次数最少,与其余组比较都有显著性差异(P<0.05);丁香酚组的平均探索次数明显多于模型组,两者比较差异有显著性意义(P<0.05)。第三部分丁香酚干预后神经形态学观察及脑内5-HT、BDNF的变化方法通过神经行为学实验可以显示丁香酚吸嗅能够改善大鼠脑缺血后的认知记忆能力。为探索丁香酚作用的机制,将干预后的各组大鼠处死取脑,脑切片行HE染色观察细胞形态。免疫组化方法测定脑区内5-HT和BDNF表达的变化。对大鼠海马CA3区进行图像分析,检测5-HT和BDNF在海马CA3区阳性反应物平均光密度。结果HE染色显示假手术组和正常组细胞数量多,排列整齐,形态呈圆形或椭圆形,结构清晰;模型组细胞数量减少,形态小而不规则,结构不清晰;丁香酚组较模型组细胞数量增加、结构较清晰。免疫组化结果显示5-HT和BDNF的免疫反应物都为棕褐色,假手术组、正常组5-HT和BDNF的免疫反应呈强阳性,丁香酚组5-HT和BDNF的免疫反应中等,模型组5-HT和BDNF的免疫反应较弱,且细胞数量较少,大鼠脑组织海马CA3区免疫组化5-HT和BDNF蛋白表达量平均光密度经组间比较,丁香酚组、正常组、假手术组与模型组比较5-HT平均光密度(P<0.01),BDNF平均光密度(P<0.05),差异有统计学意义。第四部分通过反向虚拟筛选探讨丁香酚可能的作用机制方法利用分子对接软件Surflex,以丁香酚为活性小分子探针,与sc PDB数据库中8077个蛋白晶体进行虚拟对接,找出最有可能结合的蛋白质受体,分析药物的作用机理,为下一步实验提供理论指导。反向虚拟筛选的结果不但可将以往的研究进行系统总结,还可以对丁香酚的潜在作用靶标进行预测。结果经Surflex_score打分排序,筛选出前20位的蛋白晶体作为丁香酚的药用靶标。主要有羧乙基精氨酸β-内酰胺酶,凝血酶,次甲基四氢中胆色烷尿胆素原氢化酶,氧化还原酶结核水杨酸合成酶等。打分前20位的蛋白晶体见表4。β-内酰胺酶和次甲基四氢中胆色烷尿胆素原氢化酶与丁香酚已知的抗炎抗氧化作用基本一致。凝血酶与丁香酚的结合模式见图10D,因凝血酶具有抗凝,抑制血小板聚集的作用,对于脑缺血损伤可能是丁香酚潜在的作用机制。结论1.嗅觉通路与脑缺血疾病密切相关。2.丁香酚经嗅觉通路吸嗅后可以改善MCAO模型大鼠的缺血后损伤,其机制可能与脑内海马区5-HT、BDNF的表达有关。3.通过计算机进行丁香酚靶标的反向虚拟筛选,筛选出的一部分靶点和已知文献报道的药理作用基本一致,其中凝血酶蛋白质靶点可能与丁香酚对于缺血疾病的干预治疗作用有关,可以设计下一步实验,对丁香酚改善脑缺血疾病的作用机制做进一步的探索。