慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia.CML)是一种起源于多能干细胞异常克隆的恶性增殖性疾病,约占白血病总发病率的15%,多见于老年人。绝大多数CML患者白血病细胞中具有费城染色体(Ph染色体),它是有9号染色体长臂3区4带和22号染色体长臂1区1带相互易位融合而成,使位于9号染色体上的c-abl1原癌基因在第二外显子的5’端断裂,与22号染色体的M-Bcr基因第2或第3外显子的3’端结合,形成Bcr-abl融合基因,该基因编码P210蛋白,具有持续而强烈的酪氨酸激酶活性,可使粒细胞发生恶性增殖。基于Bcr-abl融合基因在慢性粒细胞性白血病中的重要病理意义,诺华制药公司于2001成功开发Bcr-abl特异性抑制剂--STI571用于CML的治疗,成为第一个靶向治疗药物。STI571的应用使原来CML的5年生存率由20%提升至90%,被称为是CML治疗史上的里程碑。然而,随后8年随访研究发现约16%的患者因药效降低停止服用STI571,有6%的患者由于不良反应而停止用药。随着STI571在CML治疗中的大量应用,其耐药性的问题已愈发明显,尤其是Bcr-abl基因突变位点的增多,出现了越来越多STI571治愈无效的CML患者。因此,寻找抑制效能更强或Bcr-abl以外的新靶点是当前cml治疗研究的一项前沿课题。最近的研究表明cml的治疗需在抑制bcr-abl的基础上,同时联合其它新发现或确认的靶点进行联合治疗,可显著提高cml的治愈率。p15ink4b是细胞周期蛋白激酶抑制剂ink4家族的一员,又被称作cdkn2b和mts2,它位于人类9号染色体,通常与p16ink4a和p14arf一起发生改变。p16ink4a和p15ink4b都可通过抑制cdk4/6,使细胞停滞于g1期。在血液病中,p16ink4a和p15ink4b表达降低通常是由于外界原因使基因发生甲基化所导致。而且,p15ink4b是唯一在mds和aml中发生甲基化的ink4家族成员,提示它在粒细胞疾病中的具有特异性。临床研究显示50-60%的骨髓异常增殖综合症患者和70-80%急性粒细胞性白血病患者都会发生p15ink4b的甲基化改变,提示我们p15ink4b可能参与了白血病的病理过程。p15ink4b的生物学活性研究表明它具有以下3方面的特性:1.p15ink4b在体内具有肿瘤抑制因子的作用,逆转录病毒引起的髓性单核粒细胞性白血病存在明显的p15ink4b基因5’cpg岛甲基化改变,而当p15ink4b缺失被重新构建时,粒细胞增殖情况得到显著抑制。2.p15ink4b显示可以促进造血干细胞向红细胞的分化,抑制其向粒细胞的分化。3.p15ink4b在促进树突细胞成熟中的作用,增强免疫监督作用。上述三种生物学活性均表明p15ink4b可能成为治疗cml的潜在靶点。基于上述理论基础,本研究旨在观察p15ink4b与bcr-abl抑制联合应用是否可提高cml的治疗效率。为了实现这一目的,我们首先构建了p15ink4b慢病毒表达载体,通过rt-pcr方法从人外周单个核细胞中扩增p15ink4b基因,经纯化回收后连接于pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体上构建p15ink4b慢病毒表达载体。然后对p15ink4b基因进行慢病毒包装,制备p15ink4b的病毒颗粒感染k562细胞,使其稳定表达p15ink4b基因。其次,构建bcr-ablsirna,采用荧光素酶基因(基因序号m15077,394414)作为非特异性对照,将bcr-ablsirna转染k562细胞抑制p210bcr-abl的表达。同时,结合对sti571的研究,通过排列组合的方式,观察sti571,p15ink4b慢病毒感染和bcr-ablsirna转染联合作用后对k562细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡等的影响,为指导cml的治疗提供新的理论基础。1.p15ink4b慢病毒载体构建及病毒滴度测定p15ink4b慢病毒表达载体经慢病毒包装后,经逐孔稀释法测定病毒的滴度为2×108u/ml。p15ink4b慢病毒感染可显著抑制k562细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。2.bcr-abl特异性sirna可显著抑制k562细胞增殖,使细胞阻滞于g0/g1期,且具有明显的诱导凋亡的作用;本研究发现bcr-ablsirna转染可显著抑制k562细胞内p210bcr-abl蛋白的表达,转染48h时,抑制率约为85%。细胞增殖实验显示,bcr-ablsirna转染可在24-96h内显著抑制k562细胞的增殖,在48h时,可显著阻滞细胞周期,使处于g1期的细胞比例明显增加,并且可诱导细胞凋亡的出现。3.p15ink4b慢病毒感染联合bcr-balsirna或sti571对k562细胞增殖抑制作用明显加强细胞增殖实验表明,p15ink4b慢病毒感染,bcr-ablsirna转染或sti571单独应用均可显著抑制k562细胞的增殖率,且呈现明显的时间依赖性。p15ink4b慢病毒感染+bcr-abl抑制抑制效率显著高于两者单独应用;p15ink4b感染+sti571抑制效率显著高于两者单独应用,bcr-abl抑制+sti571抑制抑制效率显著高于两者单独应用,上述结果提示我们p15ink4b慢病毒感染联合bcr-abl抑制可显著提升对k562细胞增殖的抑制率。4.p15ink4b慢病毒感染联合bcr-balsirna或sti571对k562细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示,p15ink4b慢病毒感染可显著提高g1期细胞比率,降低s期细胞比率,表明p15ink4b表达可延缓dna复制。p15ink4b表达与bcr-abl抑制或sti571联合应用可显著增加处于g1期的细胞比率,提示p15ink4b与bcr-abl抑制或sti571联合应用可显著抑制dna的复制,降低细胞增殖速率。机制分析显示与单独治疗组相比,联合治疗组可显著抑制cyclind1和cdk4的表达,上述结果提示我们,联合治疗可显著抑制细胞周期依赖蛋白或激酶的表达,从而发挥阻滞细胞周期的作用。5.p15ink4b联合bcr-balsirna或sti571对k562凋亡的影响流式细胞术检测结果显示,与空载体组相比,p15ink4b慢病毒感染可显著提高细胞凋亡率,表现为annexin-v阳性细胞比率的增加。bcr-ablsirna转染和sti571亦有相似的作用。P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显著增加细胞凋亡率,提示P15INK4b与Bcr-abl抑制或STI571联合应用可显著促进K562细胞凋亡。机制分析显示,联合治疗组可显著提升Bax/Bcl-2的比值。结论:酪氨酸激酶抑制剂在CML的治疗中发挥了重要的作用,尤其是STI571的问世,大大提高了CML患者的生存时间和生存率。但是,随着STI571的大规模使用,STI571耐药性的问题凸显,这就要求我们在抑制Bcr-abl的同时,探寻新的治疗靶点以提高CML的治疗效果。P15INK4b作为经典的肿瘤抑制因子,具有抑制细胞周期蛋白激酶的功效。我们的研究显示,与单独应用Bcr-abl siRNA转染、STI571治疗或P15INK4b慢病毒转染相比,联合应用P15INK4b慢病毒转染与Bcr-abl及STI571可显著抑制K562细胞的增殖,增加细胞凋亡率,提示我们联合应用P15INK4b慢病毒感染与Bcr-abl siRNA及STI571可能具有提高CML治愈率的潜能,P15INK4b具有成为Bcr-abl以外治疗CML的潜在靶点的可能性。