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研究背景糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是世界性的公共卫生问题,其患病率与患病人数的快速增长,已严重威胁人类的健康与寿命。目前的研究认为,糖尿病主要是由β细胞质量减少、胰岛素分泌缺乏和(或)胰岛素作用障碍引起的代谢性疾病,近些年来,线粒体参与的能量代谢逐渐被人们所认知。线粒体功能障碍可导致β细胞质量和功能受损,以及胰岛素抵抗等,但具体调节机制错综复杂,可能与代谢耦合、氧化应激、钙离子代谢紊乱、线粒体生物合成下降、线粒体自噬等因素相关。但具体发病机制病仍在研究和探索中。丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)是线粒体功能的重要调控元件,可介导丙酮酸不可逆氧化为乙酰辅酶a,通过三羧酸循环影响β细胞胰岛素分泌。PDHc主要由丙酮酸脱氢酶(E1),二氢硫辛酰胺转移酶(E2)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)以及几种辅助因子构成。其中由PDHA1基因编码的E1亚单位是调控丙酮酸脱氢酶复合体最重要的组成部分,催化酶可通过调节E1亚单位上3个丝氨酸位点的磷酸化及去磷酸化来影响PDHc的活性,进而调控丙酮酸的代谢。既往研究表明,2型糖尿病啮齿类动物模型及人体中PDHc表达量降低,提示其可能在2型糖尿病发生发展中起到重要作用。但目前国内外在PDHA1对胰腺β细胞的影响尚不明确。本研究将探究PDHA1与2型糖尿病的相关性,通过构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1的转基因小鼠进一步阐明PDHA1对β细胞形态及功能的影响,并可能为2型糖尿病发生机制提供新的理论基础,为治疗提供新的分子靶点。研究方法选取2型糖尿病(db/db小鼠)模型及野生型C57BL/6小鼠各5只,免疫荧光法检测PDHA1在两种小鼠胰岛细胞中的表达情况;根据Cre-loxP系统原理,利用PDHA1flox/flox小鼠与β细胞特异性表达的Cre重组酶的小鼠杂交,4周龄时碱裂解法提取子代鼠尾DNA,PCR扩增后鉴定小鼠基因型,选取基因型为PDHA1flox/-Cre+/-的小鼠继续与PDHA1flox/flox小鼠杂交,子二代小鼠再次PCR鉴定基因型,筛选PDHA1flox/floxCre+/-小鼠为目的小鼠;选取5对同周龄、体重相近的PDHA1flox/floxCre+/-小鼠与Cre+/-小鼠分别作为实验组与对照组,8周龄时腹腔注射他莫昔芬(50mg/kg)诱导基因敲除;Westerm Blot及胰腺组织石蜡切片免疫荧光染色验证小鼠PDHA1敲除情况;qPCR检测敲除小鼠胰岛、肝脏、脂肪组织中PDHA1 mRNA的表达情况;免疫组化染色观察小鼠胰岛中PDHA1蛋白的定位及表达情况:持续观察两组小鼠毛发、发育、活动状态、血糖、体重等数据,12周龄时行葡萄糖耐量实验(IPGTT)与胰岛素耐量实验(IPITT),ELISA试剂盒检测葡萄糖刺激后30min时小鼠血清胰岛素水平;取材小鼠胰腺组织,HE染色观察小鼠胰岛β细胞形态。研究结果1、免疫荧光显示野生型小鼠胰岛中存在PDHA1蛋白的表达,与野生型鼠相比,PDHA1蛋白在糖尿病db/db小鼠中表达相对降低;说明PDHA1基因与糖尿病存在相关性。2、利用Cer-loxP系统构建胰岛β细胞特异性敲除PDHA1的转基因小鼠,4周龄时PCR扩增基因筛选PDHA1flox/floxCre+/-小鼠;8周龄时注射他莫昔芬溶液诱导敲除;Westerm Blot证实敲除小鼠胰腺中PDHA1蛋白的相对表达量明显降低(p<0.01);qPCR检测敲除小鼠胰岛、肝脏、脂肪组织中,发现仅在胰岛中PDHA1的表达量明显下降(p<0.01);免疫组化实验发现敲除小鼠胰岛中PDHA1蛋白表达较对照组明显下降。以上结果证实胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的小鼠构建成功。3、观察两组小鼠表型,在毛发、发育、活动状态、进食量、空腹血糖、体重等方面实验组与对照组小鼠并无差异,但腹腔注射葡萄糖耐量受损(p<0.01),然而胰岛素耐量实验无差异(p>0.5);ELISA试剂盒胰岛素测定显示在注射葡萄糖30min后实验组小鼠胰岛素分泌量较对照组下降(p<0.01)。4、HE染色发现实验组小鼠胰岛体积明显增大,细胞间距增宽、胞核淡染、细胞间含有空泡样存在、胞质松散。结论本实验发现2型糖尿病小鼠胰岛中PDHA1蛋白的表达量较野生型小鼠降低,提示PDHA1基因与糖尿病可能具有一定的相关性;通过Cre-loxP系统理论构建并鉴定胰岛β细胞特异性敲除PDHA1基因的转基因小鼠。虽然两组小鼠在毛发、发育、活动状态、空腹血糖、体重等方面并无差异,但敲除组小鼠葡萄糖耐量受损,且与外周组织胰岛素抵抗无关;葡萄糖刺激的胰岛素分泌明显减低,并且胰岛细胞部分代偿性增大,岛内细胞排列紊乱,胞浆中有空泡样存在。说明了 PDHA1基因在胰岛β细胞的形态维持及代谢活动中起到重要作用。