论文部分内容阅读
随着香料产业的发展,人们对于天然香料的需求日益增大,γ-癸内酯（γ-decalacton,GDL）是一种芳香化合物,天然存在于一些水果和发酵品中,GDL在香精制作以及制药等方面都有不可替代的作用。化学合成的GDL是没有光学活性的消旋体,且安全性低,而通过生物法获得的GDL,与从水果、植物中提取获得的结构相似,具有光学活性,具有天然等同效应,因此用生物法生产GDL具有更广阔的发展前景。本课题将来源于格氏乳球菌的油酸水合酶基因在大肠杆菌BL21中实现外源表达,研究重组菌诱导条件以及重组酶的酶学性质,运用重组油酸水合酶与解脂耶氏酵母协同转化油酸合成GDL,并优化条件提高GDL产量。具体内容如下:（1）克隆了来源于格氏乳球菌的油酸水合酶基因,将油酸水合酶基因与pET28a载体相连,转化进大肠杆菌BL21,获得重组大肠杆菌ZJLgohA。经基因序列测序分析,结果正确,共1764 bp。通过SDS-PAGE蛋白电泳分析,证明来自格氏乳球菌的重组油酸水合酶诱导表达成功,其理论蛋白分子量为67.2 kDa。将重组菌ZJLgohA在添加了4 mg/mL阿拉伯糖的LB培养基中进行诱导培养,添加1.0 mM IPTG,在37oC诱导8 h,蛋白含量达最大值为1.2 mg/mL。（2）将菌液浓缩10倍进行超声破碎释放重组酶,超声工作条件为:超声功率17%,超声1 s停顿4 s,工作时间40 min。利用C端6×His标签分离纯化蛋白,用50 mM咪唑洗脱,可得纯酶,经过SDS-PAGE电泳分析,得到了较纯的单一条带,蛋白浓度达2.5 mg/mL,是未纯化酶的2.05倍,酶活力为152 U/mL,米氏常数Km值为0.69±0.02 g/L,Vmax值为0.96×10-3±0.03×10-3g/L/min。将酶保存于10%甘油中,-20°C保存40天后,残存酶活约86%。Mg2+对油酸水合酶酶活有很好的促进作用,可使酶活提高3.5倍。纯化酶最佳反应条件为:在pH 7.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系中,乙醇浓度为4%,油酸浓度为30 g/L,在30°C反应8 h,可转化生成10-羟基硬脂酸2.3 g/L,油酸转化为10-羟基硬脂酸转化率为7.2%。（3）将油酸水合酶协同解脂耶氏酵母转化油酸生成γ-癸内酯,将油酸水合酶和油酸在解脂耶氏酵母发酵24 h和36 h时间歇补料,此时GDL产量最高达到3.7 g/L。通过单因素实验和响应面实验对吐温-80,豆粉,硝酸铵,硫酸亚铁添加量进行考察,得出最佳培养基参数为:吐温-80 0.23%,豆粉3.46%,硝酸铵1.35%,FeSO4 0.18%,γ-癸内酯的产率4.72g/L,油酸转化为GDL的转化率为26.15%。