【摘 要】
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目的探究PLAA（磷脂酶A2激活蛋白）基因参与尿酸盐晶体（MSU）诱导的炎症反应的机制。方法1.使用PLAA基因过表达/干扰慢病毒载体及其对应空载病毒载体转染THP-1细胞,并使用q RT-PCR测定PLAA表达量、Western Blot测定细胞内PLAA蛋白表达水平,获得PLAA高表达THP-1细胞株及转染其对应空载病毒细胞株、PLAA低表达THP-1株及转染其对应空载病毒细胞株。用佛波醇（P
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目的探究PLAA（磷脂酶A2激活蛋白）基因参与尿酸盐晶体（MSU）诱导的炎症反应的机制。方法1.使用PLAA基因过表达/干扰慢病毒载体及其对应空载病毒载体转染THP-1细胞,并使用q RT-PCR测定PLAA表达量、Western Blot测定细胞内PLAA蛋白表达水平,获得PLAA高表达THP-1细胞株及转染其对应空载病毒细胞株、PLAA低表达THP-1株及转染其对应空载病毒细胞株。用佛波醇（PMA）诱导上述四种细胞株及未转染慢病毒的THP-1细胞株,使其分化成单核-巨噬细胞M0型。加入MSU刺激后,使用q RT-PCR、ELISA测定IL-1β、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达和分泌情况,以明确在体外单核-巨噬细胞中,PLAA表达水平的不同,对MSU诱导的炎症因子的影响。2构建敲除骨髓单核-巨噬细胞PLAA基因的条件性敲除小鼠（c KO）及其对照小鼠（CTR-c KO）。将c KO与CTR-c KO小鼠进行繁殖扩群,PCR鉴定子代小鼠基因型及Western Blot检测骨髓单核-巨噬细胞PLAA蛋白表达量。取8-12周龄的雄性c KO及CTR-c KO小鼠,腹腔注射MSU构建急性腹膜炎模型,6小时后收集腹腔灌洗液,计算腹腔灌洗液炎性细胞数量,ELISA检测灌洗液上清IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α分泌量,探究PLAA基因在骨髓单核-巨噬细胞缺失,对MSU诱导的小鼠急性腹膜炎炎症细胞渗出、炎症因子表达的影响。提取c KO及CTR-c KO鼠的原代骨髓细胞,用含L929细胞培养上清的培养基诱导分化获得成熟的骨髓单核-巨噬细胞,使用MSU刺激后提取RNA,进行转录组测序,进行差异基因分析。结果1.PLAA基因高表达/低表达THP-1细胞株构建成功。在MSU的刺激下,PLAA过表达的THP-1细胞株,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αm RNA相对表达量明显高于PLAA野生型及转染其对应空载病毒的THP-1细胞株,差异具有统计学意义（P<0.01）。PLAA低表达的THP-1细胞株的IL-1β、IL-6、IL-8 m RNA相对表达量明显低于PLAA野生型及转染其对应空载病毒的THP-1细胞株,差异具有统计学意义（P<0.01）,TNF-αm RNA相对表达量未见明显差异。同时,ELISA结果显示,MSU刺激下,PLAA高表达的细胞株IL-1β、IL-8、TNF-α分泌明显高于PLAA野生型及转染其对应空载病毒的THP-1细胞株,PLAA低表达的THP-1的IL-1β、IL-8、TNF-α分泌明显低于PLAA野生型及转染其对应空载病毒的THP-1细胞株,差异均具有统计学意义（P<0.01）。2.敲除骨髓单核-巨噬细胞PLAA基因的条件性敲除小鼠构建成功。小鼠腹腔灌洗液炎症因子结果显示:c KO小鼠腹腔灌洗液中的炎症细胞数较CTR-c KO小鼠明显减少（P<0.01）。腹腔灌洗液上清中,较CTR-c KO而言,c KO小鼠IL-1β、IL-8明显降低（P<0.01）,IL-6、TNF-α则无明显差异。转录组学测序结果:发现了193个与PLAA缺失相关的差异基因,对差异基因分析发现其与多个炎症通路有关。结论PLAA基因高表达/低表达THP-1细胞株构建成功;PLAA高表达/低表达会使MSU诱导的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达和分泌相应的增强或降低,PLAA通过调节这些炎症因子的表达和分泌,参与到痛风炎症发作中。骨髓单核-巨噬细胞条件性敲除小鼠构建成功;MSU诱导的PLAA c KO及CTR-c KO小鼠的急性腹膜炎模型显示,在骨髓单核巨噬细胞中PLAA基因缺失,可以使MSU诱发的急性腹膜炎中炎症细胞渗出减少,IL-1β、IL-8分泌降低。通过转录组测序,我们发现了与炎症相关的基因及通路,为后续研究PLAA参与痛风炎症过程的机制提供了思路。
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