志贺菌是细菌性痢疾(简称菌痢)的病原体,从发现至今已有百余年的历史。志贺菌感染目前仍是全球影响公共卫生健康的重要问题。在中国,细菌性痢疾每年的发病数接近50万,发病率居37种监测感染性疾病的前几位,对公众健康造成严重威胁。抗生素应用于细菌性痢疾的治疗以后,耐药率逐年上升。上世纪七十年代喹诺酮类药物开始应用于临床并且已成为当前治疗细菌性痢疾的首选用药。但是,随着该类药物的广泛应用,近年来耐药问题日益严重。研究目的：为了解天津地区近三年来志贺菌对临床常用抗菌药物的耐药情况及探讨对氟喹诺酮的耐药机制,本课题选取2009年-2011年天津地区三家三级甲等医院肠道门诊分离的志贺菌临床株,进行血清学分型及抗生素药敏试验,并对氟喹诺酮耐药株从染色体靶位酶基因突变及质粒介导两个方面探讨其对氟喹诺酮类药物的耐药机制。材料与方法：收集自天津市三家三级甲等医院2009年、2010年及2011年5月-9月肠道门诊患者粪便标本的志贺菌临床株139株,采用血清凝集法鉴定其血清学分群及分型,明确本地区优势流行血清型。采用K-B纸片扩散法用17种临床常用抗生素进行药敏试验,分析并比较志贺菌不同血清群对不同抗菌药物的耐药程度。其中采用环丙沙星、左氧氟沙星等4种抗生素筛选氟喹诺酮类耐药株,并通过PCR扩增技术对氟喹诺酮耐药志贺菌的gyrA、parC基因及所有菌株的gnrA、 qnrB.qnrS.aac(6’)-Ib-cr.qepA基因进行扩增、测序,测序结果在Genebank上进行比对。将PMQR基因阳性菌株与大肠埃希菌J53ARZ进行质粒接合实验,采用微量肉汤稀释法比较受体菌对抗菌药物的敏感性变化。对供体菌、受体菌及接合菌提取质粒,进行质粒图谱分析及特异性PCR扩增确认含PMQR基因质粒成功导入受体菌。实验结果：1、经常规生化及血清凝集实验证实,139株志贺菌包括福氏志贺菌17株(包括1a、2a、2b、4、5b、6及X、Y变种),宋内志贺菌121株及鲍氏志贺菌1株。天津地区近三年志贺菌主要流行血清群为宋内志贺菌,其次为福氏志贺菌F2a。药敏结果显示：139株志贺菌对一代喹诺酮萘啶酸敏感率最低,为1.44%,其次是氨苄西林、复方磺胺甲噁唑和链霉素,敏感率分别为2.22%、3.59%及4.32%,3种及3种以上抗生素多重耐药菌株接近98%。福氏志贺菌与宋内志贺菌对多种抗生素耐药程度存在差异,对氟喹诺酮及三代头孢耐药程度明显高于宋内志贺菌。2,本研究总共筛选出氟喹诺酮耐药志贺菌5株,均为福氏志贺菌,耐药率为3.59%(5/139)。宋内志贺菌无氟喹诺酮耐药菌,但对萘啶酸耐药程度较高。5株氟喹诺酮耐药菌耐药程度均较高,其中2株对左氧氟沙星同时耐药。耐药菌在gyrA、parC基因均有突变且突变基因及位点具有多态性,突变株中均有gyrA83(Ser→Leu)及parC80(Ser→Ile)位点突变,其中左氧氟沙星耐药株N8与其余4株菌相比缺乏gyrA基因87位点突变,其余4株菌均同时存在gyrA87(Asp→Gly.Asn)位点突变。139株志贺菌中共检出4株PMQR基因阳性株,1株qnrS1阳性菌N8为福氏志贺菌,对氟喹诺酮耐药；3株aac(6’)-Ib-cr基因阳性菌均为宋内志贺菌,对氟喹诺酮敏感。通过质粒接合实验获得3株接合株,提取质粒后发现大小约10kb的质粒从供体菌转移到受体菌中,提取接合菌DNA均扩增出了相应PMQR基因,药敏结果显示qnrS1及aac(6’)-Ib-cr基因分别使受体菌在质粒接合前后对环丙沙星和诺氟沙星的MIC分别提高了16、8和4、4个稀释度,对左氧氟沙星和氧氟沙星的MIC分别提高了16、8和1、4个稀释度,但都达不到临床意义的耐药临界值。进一步印证了PMQR基因介导低水平耐药的推断,并提示qnr介导喹诺酮耐药程度要高于aac(6’)-lb-cr。实验结论：本地区近3年志贺菌主要流行血清群为宋内志贺菌,其次为福氏志贺菌F2a。志贺菌对多种抗生素耐药率较高,且多重耐药菌株比例高。福氏志贺菌与宋内志贺菌对多种抗生素耐药程度存在差异,对氟喹诺酮及三代头孢耐药程度明显高于宋内志贺菌。对氟喹诺酮类药物耐药率低于5%,且全部为福氏志贺菌。在天津地区志贺菌中分离出质粒介导的喹诺酮耐药基因,既往未见报道,志贺菌氟喹诺酮药物耐药机制同时存在染色体介导的靶位酶突变及携带PMQR基因,但以靶位酶突变为主。PMQR基因可在不同菌株间水平传递,引起喹诺酮耐药性的水平传播。