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禽白血病（AL）是指由禽白血病病毒（ALV）引起的以禽类某些造血细胞过度增生并诱发肿瘤为主要特征的一类传染性疾病。近三十年来,该病在全球范围内迅速传播,给世界养禽业带来了巨大的经济损失。禽白血病病毒可分为内源性病毒和外源性病毒,其中ALV-J、ALV-A、ALV-B是临床常见的外源性ALV,主要引起淋巴细胞性白血病和髓细胞性白血病,具有较强的致病性;ALV-E为内源性ALV,没有致瘤性。目前,针对经典的禽白血病各亚群的检测技术已非常成熟,被广泛应用于临床诊断和鸡群净化,并有商品化的试剂盒问世。但是,K亚群禽白血病病毒（ALV-K）作为2012年新分离鉴定到的一个亚群,目前针对它的研究尚且不足,缺乏快速有效的检测方法。因此,本研究拟通过建立针对ALV-K荧光定量RT-PCR和RT-LMAP检测方法,旨在快速、特异地鉴别出ALV-K,为禽白血病防控与净化提供技术支持。为建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测ALV-K的方法,本研究根据GenBank数据库上GDFX0601株（登录号:KP686142.1）亚群特异性抗原（gp85）的基因序列,分别设计了一对特异性的引物和相应的探针,构建阳性重组质粒,制作标准曲线,并对反应条件和反应体系进行优化。结果显示,基于TaqMan的荧光定量RT-PCR检测ALV-K具有良好的特异性,该方法能够有效区分其他亚群禽白血病病毒。阳性重组质粒在3.4×1010copies/μL3.4×101copies/μL之间呈现良好的线性关系,y=-3.402x+48.355,斜率为-3.402,相关系数R2为0.998,扩增效率Eff%为96.768;该方法最低能够检测到3.4×101copies/μL的核酸,灵敏度是普通PCR的100倍;批内变异系数和批间变异系数均小于5%。对1日龄SPF鸡接种4×104TCD50 ALV-K分离株,在鸡四月龄时进行剖检,通过绝对定量法,与标准品扩增曲线进行比对,得到各组织脏器的模板拷贝数。结果表明,在鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均能检测到ALV-K,且肝脏、肾脏和脾脏中的病毒含量显著高于心脏和肺脏（P<0.05）,这为进一步研究ALV-K的组织分布、感染和致病机制奠定了基础。为建立RT-LAMP检测ALV-K的方法,本研究根据GenBank数据库中ALV-K GDFX0601株的全基因序列,在其高度保守区域,设计了一对特异性的内引物（FIP/BIP）和外引物（F3/B3）,通过对引物浓度和反应温度优化,结果显示,当内引物和外引物的浓度分别为1.6μM和0.1μM,反应温度为61℃,恒温反应60min时,反应达到最小的Ct值和最大的荧光度,能够对ALV-K进行高效扩增,最低能够检测到3.4×104copies/μL的核酸。应用所建立的RT-LAMP检测方法,随机抽取珠海某鸡场专供澳门的40只肉鸡进行检测,结果表明,肉鸡均未受到ALV-K污染。RT-LAMP检测方法操作简便,反应时间短,对仪器要求不高,适合在出入境口岸、养殖场等地推广应用。综上所述,本研究成功建立了针对K亚群禽白血病病毒的荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测方法,该方法能够快速、高效、准确、特异地检测出ALV-K,这为今后禽白血病的诊断和净化工作提供了有力的技术支持。