背景与目的已有研究报道TLR4表达在免疫细胞、炎症细胞和足细胞。Fibrinogen可以通过Toll-like receptor 4(TLR4)参与血管壁疾病、类风湿性关节炎等多种疾病的炎症。Fibrinogen激活巨噬细胞分泌白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子、单核细胞趋化蛋白1。足细胞损伤是形成蛋白尿的一个重要原因,可导致肾小球硬化症。有报道体外实验中fibrinogen通过TLR4刺激足细胞分泌趋化因子和细胞因子。我们最近的研究发现尿液fibrinogen水平在局灶节段肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者中是显著升高的。Fibrinogen是否可以通过TLR4信号通路导致足细胞破坏尚未可知。因此,本研究的目的:(1)探索fibrinogen是否导致足细胞细胞骨架破坏和凋亡增加?(2)Fibrinogen是否通过TLR4-p38MAPK-NFκB P65信号通路介导上述效应?(3)Fibrinogen是否参与FSGS中足细胞的损伤?材料与方法(1)在体外培养的人足细胞中加入fibrinogen(分别为20μg/ml,200μg/ml,80μg/ml三个剂量),对照组加入等量PBS;分别孵育12h和24h。利用流式细胞术检测凋亡率情况和免疫荧光检测细胞骨架F-actin。在体外siRNA转染实验中,先分别利用controlsiRNA、TLR4 siRNA转染足细胞12h,再加入fibrinogen(800μg/ml)孵育24h。然后通过qRT-PCR检测TLR4mRNA水平,观察阻断效果。利用流式细胞术检测足细胞凋亡率,免疫荧光检测F-actin。同时Western Blot检测足细胞TLR4、总NFκB p65、磷酸化NFκB p65、总p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的水平。(2)在阿霉素小鼠FSGS模型中,分别于第1周、2周、4周、6周收集尿和肾脏。检测尿 ACR(the ratio of albumin to creatinine);利用 ELISA 法检测尿上清液fibrinogen的水平。对尿液fibrinogen与尿ACR、足突融合进行相关性分析。对小鼠肾脏进行病理检查(PAS染色、光镜、电镜);免疫荧光双重染色分别检测podocin与TLR4,fibrinogen与TLR4的共定位表达水平。统计学方法所有的细胞实验重复三次以上。连续变量数值以均数±标准差(SD)或中位数(四分位间距,第25和第75百分位数)表示。GraphPad Prism 5软件(La Jolla,CA)进行统计分析,双侧t检验、非参数检验用来分析任意两组间的差异。变量之间的相关性使用Spearman’s相关分析方法进行。P<0.05认为有统计学差异,P<0.01认为差异更显著。结果(1)200μg/ml,800μg/ml fibrinogen干预可引起足细胞细胞骨架F-actin的明显破坏和凋亡率显著增高,与未处理组比较该差异有统计学意义。(2)在转染实验中,与 control siRNA+fibrinogen 组比较,TLR4 siRNA+fibrinogen(800μg/ml)组中足细胞的凋亡率显著降低,F-actin的破坏亦明显减轻。TLR4 mRNA表达下调和蛋白表达减少;磷酸化NF κB p65和磷酸化p38 MAPK的水平降低,Fibrinogen介导的TLR4信号通路下游分子NF κB p65和p38 MAPK的活化被抑制。(3)阿霉素小鼠FSGS模型的尿液ACR和fibrinogen水平显著高于生理盐水处理小鼠组,并且尿液fibrinogen和ACR成正相关(r=0.65,P<0.001)。6周时阿霉素处理组小鼠的肾脏PAS染色可见FSGS样病理改变,电镜示足突融合程度较生理盐水处理组严重(P<0.001)。免疫荧光双重染色结果显示:阿霉素处理组小鼠肾脏podocin的表达较生理盐水组显著减低(P=0.0001);而fibrinogen与TLR4共定位表达且增高,与生理盐水组比较均有统计学差异(P<0.0001)。结论Fibrinogen可以通过活化TLR4-p38 MAPK-NFκB p65信号通路介导足细胞的细胞骨架破坏和凋亡;可能藉此参与FSGS足细胞的损伤。背景与目的慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)是一个全球健康问题和进展性疾病,有较高的心血管疾病、终末期肾脏病等并发症风险。我们之前发现fibrinogen通过TLR4介导足细胞细胞骨架破坏和细胞凋亡;FSGS患者尿液fibrinogen水平是显著增高的。另有研究报道fibrinogen参与肾纤维化。然而,尿液fibrinogen能否反映FSGS患者病情的活动与缓解尚待探索;尿液fibrinogen与CKD患者肾脏远期预后的相关性研究资料亦有限。基于之前的资料,本研究的目的:(1)探索尿液fibrinogen水平的变化和FSGS疾病活动之间的关系;(2)探索尿液fibrinogen对CKD患者长期肾生存的影响。对象与方法1.为了研究尿液fibrinogen水平和FSGS病情活动的关系,从南京总医院国家肾脏病临床研究中心入组50例FSGS和50例健康对照。利用ELISA法检测尿液fibrinogen水平。在FSGS患者中对足突融合程度进行定量分析。并将尿液fibrinogen分别与24h蛋白尿、足突宽度进行相关性分析。同时分析了服用强的松治疗前后尿液fibrinogen水平的变化与FSGS病情活动度的关系。2.为了探索尿液fibrinogen对CKD患者长期肾生存的影响,从南京总医院国家肾脏病临床研究中心入组402例CKD1-4期患者,包括101例糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN),94 例特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN),55 例特发性 FSGS(idiopathic focal segmental glomerulonephritis,FSGS)和 152 例 IgA 肾病患者(IgA nephropathy,IgAN)。纳入标准:蛋白尿>0.3 g/24 h;病理类型均经肾活检证实;eGFR≥15ml/min/per1.73m2;18-65岁。排除标准:继发性因素;病毒感染;肾脏病家族史。中位随访时间35个月(IQR:24.33-78.00月)。收集患者年龄、性别、血压、24h尿蛋白和血清白蛋白数据。尿液fibrinogen由ELISA方法检测,并用尿肌酐进行校正。eGFR由CKD-EPI公式计算。肾脏终点(ESRD)定义为eGFR<15 ml/min/per 1.73 m2或接受肾脏替代治疗持续3月以上。肾小管萎缩间质纤维化(Interstitial Fibrosis and Tubular Atrophy,IFTA)评分:0,无;1,<25%;2,25-50%;3,>50%总面积。肾小球节段硬化:<50%;球性硬化:肾小球的50%以上硬化。统计学方法利用SPSS19.0(Chicago,IL)进行数据分析。非正态分布的数据以中位数(四分位间距,第25和第75百分位数)表示;分类变量则以百分比表示。双侧Mann-Whitney检验或Kruskal Wallis检验用于比较组间差异。配对t检验用来分析强的松治疗前后尿液fibrinogen水平的变化。Spearman’s相关分析法用以进行变量间的相关性检验。尿液fibrinogen/cr原始数值进行logi0转换后再进行Logistic回归和Cox回归分析。双分类Logistic回归用于分析影响肾脏终点的危险因素。Kaplan-Meier方法进行肾脏的生存分析。利用ROC曲线下面积的比较来判断不同模型预测肾脏生存的优劣,并利用似然比检验、AIC(Akaike information criterion),IDI(Itegrated Discrimination Improvement)、NRI(Net Reclassification Improvement)对不同的模型进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果尿液fibrinogen水平与FSGS疾病活动相关FSGS患者尿液fibrinogen水平是显著高于正常人(P<0.001)。FSGS患者尿液fibrinogen分别与24h蛋白尿成正相关(r=0.55,P<0.0001),与足突宽度成正相关(r=0.73,P<0.0001)。强的松治疗后,完全缓解组(n=29例)与治疗前比较尿液fibrinogen水平显著降低(P<0.0001);而未缓解组(n=21例)尿液fibrinogen水平在治疗前后无明显差别(P=0.48)。尿液fibrinogen是影响CKD患者肾脏生存的独立危险因素按尿液fibrinogen水平将CKD患者分为三组:tertile1(低水平组),tertile2(中等水平组),和tertile3(高水平组)。CKD患者尿液fibrinogen水平显著高于正常对照组(P<0.0001)。在CKD1-4期(包括FSGS,IMN,IgAN和DN)患者,尿液fibrinogen分别与蛋白尿正相关(r=0.644;P<0.0001),与IFTA正相关(r=0.104;P=0.037);而尿液fibrinogen与eGFR负相关(r=-0.198;P<0.0001)。尿液fibrinogen与肾小球球性硬化和阶段硬化之间无相关性。在随访期间16.9%(68/402)发生ESRD。Kaplan-Meier分析表明基线尿液fibrinogen水平越高,发生ESRD的风险越大。CKD患者的长期肾生存率:tertile 3<tertile 2<tertile 1。经单变量和多变量logistic和Cox回归分析证实,基线尿液fibrinogen是CKD进展至ESRD的独立危险因素,在校正年龄、性别、高血压、蛋白尿、疾病类型、eGFR和IFTA后基线尿液fibrinogen仍具有统计学意义。增加尿液fibrinogen可以改善模型预测CKD患者发生ESRD的准确度。相对于由eGFR、蛋白尿和高血压组成的模型基础上,加入尿液fibrinogen的模型(由尿液fibrinogen、eGFR、蛋白尿和高血压组成)可以使得AUC从0.73增加到0.76(经似然比检验有统计学差异,P=0.0033),AIC从333.64降到326.99。另外,我们分层分析了模型在DN和non-DN患者中的预测价值,发现加入尿液fibrinogen的模型在DN患者中预测新发ESRD更好。结论1.尿液fibrinogen可以反映FSGS病情活动及对强的松的治疗反应。2.尿液fibrinogen作为一项非侵入性的指标是预测CKD1-4期(包括FSGS,IMN,IgAN和DN)患者进展至ESRD的独立危险因素。