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研究背景和目的:Xp11.2易位性肾癌是WHO新分类的一种肾癌,发病年龄轻、预后较差,主要特征为TFE3基因发生易位,导致其过表达。因目前尚无针对过表达TFE3建立的肾癌细胞学模型,故作用机制尚不明确,涉及的信号通路有待研究,其诊断及治疗缺乏理论基础。目的:1.筛选出适合构建过表达TFE3慢病毒感染的肾癌细胞系,构建并鉴定特异性慢病毒载体颗粒。2.建立慢病毒过表达TFE3稳定感染的肾癌细胞系,研究过表达TFE3对其生物学影响。3.明确mTOR及pS6在Xp11.2易位性肾癌及过表达TFE3细胞系中的表达,探讨PI3K/AKT/mTOR通路在该类肿瘤中的作用。4.Affymetrix基因芯片检测Xp11.2易位性肾癌相关的差异基因,筛选出更多精确的靶基因。方法:1.Real time PCR和Western blot方法检测8种肾源性的细胞系中TFE3的表达水平,筛选一株进行后续实验,构建特异性慢病毒过表达载体颗粒并鉴定其感染效率。2.构建稳定感染过表达TFE3的肾癌细胞系,分为过表达组(OE),阴性对照组(NC)和空载对照组(CON),并用Western blot进行验证。3.MTT、平板克隆法检测不同实验组的细胞增殖和克隆形成;利用流式细胞仪检测其细胞周期。4.免疫组化方法检测12例Xp11.2易位性肾癌和27例非Xp11.2易位性肾癌中mTOR和pS6的表达情况,同时用Western blot方法检测不同细胞实验组中两者的差异。5.Affymetrix基因芯片分析2例Xp11.2易位性肾癌患者癌组织与癌旁组织之间基因表达谱的差异。结果:1.Real-time PCR结果显示TFE3基因在ACHN中表达丰度为中,Western blot结果显示在ACHN中无目的条带,因此选取ACHN细胞系作为靶细胞进行慢病毒感染。成功构建人TFE3特异性慢病毒过表达载体并获得相应高效率慢病毒。2.在实验组中,OE组病毒滴度=2×108TU/ml,MOI=10,Western blot结果显示OE组中检测到95KD的目的条带,表明过表达TFE3稳定感染ACHN细胞成功。OE组的细胞增殖水平和克隆数较NC组显著升高(P<0.05),说明过表达TFE3能够促进ACHN细胞的增殖和克隆形成。细胞周期结果显示,OE组较NC组的S期延长(P<0.05),说明过表达TFE3能够调控ACHN细胞的周期从而促进细胞增殖。3.免疫组化法检测石蜡标本中的mTOR和pS6在Xp 11.2易位性肾癌较非Xp 11.2易位性肾癌中阳性率显著升高(P<0.05),两种蛋白在OE组中表达显著增高(P<0.05),说明该肿瘤在组织学和细胞学层面都存在PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。4.Affymetrix基因芯片检测Xp11.2易位性肾癌患者相关差异表达的基因。共筛选出差异表达基因1479个,癌组织中上调基因790个,下调基因689个。其中泛素化相关的RNF180基因下调5倍以上,提示该种肿瘤可能与泛素化有关。结论:1.过表达TFE3能够促进ACHN细胞的增殖,调控其细胞周期。2.在Xp 11.2易位性肾癌中存在PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。3.Xp11.2易位性肾癌可能与泛素化途径相关。