【摘 要】
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大豆皂苷是大豆中一类重要的功能成分。大豆皂苷主要分为A类、DDMP类、B类和E类4类。A类皂苷末端糖基乙酰化导致大豆及其制品具有苦味和涩味,而DDMP类、B类和E类皂苷具有多种对人体有益的生理功能。A类皂苷缺失大豆材料的种子及制品的口感明显得到改进。GmSg-5基因是A类皂苷代谢的关键酶基因。为了改进大豆食品的口感并提高皂苷生物活性成分的含量,对GmSg-5基因表达模式进行分析和从基因水平建立快速
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目（201703D221004-5,201803D221020-2）； 山西省重点研发计划重点项目（201703D211001）； 山西省自然科学基金（2016011076,201901D111225）；
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大豆皂苷是大豆中一类重要的功能成分。大豆皂苷主要分为A类、DDMP类、B类和E类4类。A类皂苷末端糖基乙酰化导致大豆及其制品具有苦味和涩味,而DDMP类、B类和E类皂苷具有多种对人体有益的生理功能。A类皂苷缺失大豆材料的种子及制品的口感明显得到改进。GmSg-5基因是A类皂苷代谢的关键酶基因。为了改进大豆食品的口感并提高皂苷生物活性成分的含量,对GmSg-5基因表达模式进行分析和从基因水平建立快速、简便、经济的鉴定方法对今后大豆品质育种显得非常重要。为此本文开展了三个方面研究,首先从晋遗30克隆GmSg-5基因,对基因序列、蛋白质序列和启动子序列进行分析;其次利用q RT-PCR技术对GmSg-5基因根、茎、叶不同组织、籽粒发育不同时期和盐胁迫条件下的表达模式进行了分析;通过比对大豆A类皂苷合成关键酶基因GmSg-5/Gmsg-5基因序列,找出单核苷酸多态性（SNP）位点,根据SNP位点分别设计了GmSg-5/Gmsg-5基因的特异探针,开发基于DNAzyme的缺口连接酶链式反应（Gap-LCR）鉴定GmSg-5/Gmsg-5基因特异性的可视化快速检测方法,为今后快速筛选大豆A类皂苷缺失大豆材料奠定基础。主要研究结果如下:1、本研究利用GmSg-5-F/GmSg-5-R引物扩增出GmSg-5基因,对其核苷酸序列进行多态性分析发现在355位点G→A的变异引起氨基酸序列由天冬氨酸突变为天冬酰胺。对GmSg-5基因蛋白二级结构分析发现α-螺旋所占比例最高为52.25%;三级结构分析发现主要由HEME和CPR两个结构域构成。系统发育分析发现GmSg-5基因与Phvul005g065000等基因亲缘关系最近。2、q RT-PCR分析发现GmSg-5基因在根中表达最高。籽粒不同发育时期的表达基本呈现先增高后降低的趋势,开花后50 d的籽粒中GmSg-5基因的表达量最高。结果表明GmSg-5基因的表达与不同组织和籽粒不同发育时期A类皂苷含量基本一致。3、Na Cl胁迫前期根中GmSg-5基因的表达受到抑制,后期胁迫诱导了GmSg-5基因的表达;Na Cl胁迫严重抑制叶片中GmSg-5基因的表达。4、根据GmSg-5/Gmsg-5基因1127 SNP位点的G/A变异,分别设计了GmSg-5和Gmsg-5基因的两套特异性互补探针L*、R、Ln、Rn*和L、R、Ln、Rn。5、通过优化Gap-LCR反应体系,结果表明模板浓度0.2μmol·L-1、缓冲液p H值8.4、探针浓度1.2μmol·L-1为最优反应体系对Gap-LCR反应程序进行了优化,结果表明延伸时间1 min即可完成Gap-LCR反应,大大缩短了反应时间。对显色反应时间进行了优化发现显色反应10 min为最佳显色时间。6、利用Gap-LCR反应最优体系和最优显色时间实现GmSg-5/Gmsg-5基因互补探针的可视化特异性检测。总之,GmSg-5基因具有组织表达和时空表达特异性,GmSg-5基因的表达与不同组织和籽粒不同发育时期A类皂苷含量基本一致。从基因水平上建立了一种鉴定A类大豆皂苷缺失的可视化检测方法,该方法快速、简单、实用、经济。
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