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研究背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,因其组织来源广泛、免疫原性低并具免疫调节作用而成为临床上最具应用前景的一类干细胞。RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)能够在转录后水平调控基因表达,进而影响细胞增殖、分化、迁移与凋亡等一系列生物学特性。NOVA1(neuro-oncological ventral antigen 1)最初被认为是神经特异性的RBP,对神经细胞的存活以及发育至关重要,参与神经突触蛋白基因的选择性剪接;随后,NOVA1在肿瘤细胞和棕色脂肪发育中的作用也相继被发现。我们的前期研究显示,在人MSCs成脂分化过程中NOVA1表达升高,而NOVA1在MSCs成脂分化中的作用及其调控机制有待深入研究。研究MSCs成脂分化机制对于我们了解脂肪组织的发育、治疗脂肪细胞分化失衡的疾病具有重要的理论与临床意义。研究目的1.明确脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)与骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)正常培养及成脂分化过程中NOVA1的动态表达变化,并通过敲减和过表达实验明确NOVA1对MSCs凋亡、迁移以及成脂分化的影响。2.探讨NOVA1调节MSCs成脂分化的分子机制。3.探讨影响NOVA1基因表达的相关因素。研究方法和结果1.MSCs及其成脂分化过程中RBPs的表达变化方法:采用油红O染色与茜素红染色以及流式细胞鉴定人脂肪组织中分离的ADSCs;通过Real-time PCR检测成脂分化过程中12个RBPs的表达;采用Real-time PCR检测人MSCs向成骨、成肌分化过程中NOVA1的表达;采用免疫荧光或免疫组化的方法对ADSCs成脂分化过程和人腹部皮下脂肪组织中NOVA1蛋白表达进行检测;采用Real-time PCR检测大鼠各组织中Nova1的表达。结果:分离得到人ADSCs高表达CD44、CD73、CD90、CD105等间充质干细胞表面标志物,不表达CD45、CD34、CD11b、CD19和HLA-DR。ADSCs成脂诱导过程中,hnRNPH1和PTBP1在诱导7天表达显著升高;hnRNPH2、RBM38、NOVA1在诱导3天和7天表达均显著升高,其中NOVA1升高程度最为明显,而FOXC2 在诱导 3 天和 7 天表达降低。TIA1、TIAL1、hnRNPF、hnRNPA1、hnRNPM、FOX2在ADSCs成脂分化过程中未发生明显变化。MSCs向成骨、成肌方向分化过程中未检测到NOVA1的表达发生明显变化;免疫荧光显示,未诱导的ADSCs中NOVA1主要在细胞质中表达,有明显的核质表达区别,而在成脂诱导中,细胞质和细胞核中表达均升高,核质表达差别不明显;人腹部皮下脂肪组织中NOVA1主要在成熟脂肪细胞的细胞核中表达;基质血管成份中NOVA1的表达远低于成熟脂肪组织;比较大鼠心脏、骨骼肌、脂肪、肝、肺、肾等组织,发现在脂肪组织中Nova1表达最高,骨骼肌中次之,肾中表达最低。2.NOVA1对MSCs凋亡和迁移以及成脂分化的影响方法:NOVA1敲减后采用流式细胞术检测ADSCs凋亡情况并利用划线法检测其迁移能力。为了研究NOVA1对MSCs分化能力的影响,通过在MSCs中敲减和过表达NOVA1并进行成脂诱导,在不同时间点采用Real-time PCR的方法检测成脂标志基因的表达,诱导7天采用油红O染色观察脂滴形成情况。结果:NOVA1敲减后ADSCs凋亡水平增加,迁移能力下降。敲减NOVA1抑制MSCs成脂分化,过表达NOVA1后MSCs成脂分化能力增加。过表达NOVA1后即使不添加成脂诱导液,7天后成脂分化标志物ADIPOQ的表达仍升高,但未见脂滴形成。3.NOVA1在MSCs成脂分化中的作用机制方法:两组ADSCs分别感染NOVA1敲减(shNOVA1)及对照(Scramble)慢病毒后,收取RNA并命名为shNOVA1和Scramble,另取两组ADSCs感染NOVA1敲减及对照慢病毒后成脂诱导3天,收取RNA并命名为shNOVA1_A3和Scramble_A3,对四组样本进行全转录本表达谱芯片检测以及差异基因GO分析和通路富集(pathway)分析;采用Western blot的方法对敲减NOVA1后成脂分化过程中未折叠蛋白应答(unfolded protein response,UPR)相关蛋白表达进行验证;在成脂诱导液中添加250nM的内质网应激激动剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)处理7天,与未添加TG组比较脂滴的形成以及成脂分化标志基因的表达,western blot检测UPR相关蛋白的表达;STRING网站对能够与NOVA1相互作用的蛋白进行预测,通过IP实验对预测到的蛋白进行验证,并通过在ADSCs中敲减该蛋白后成脂诱导,检测成脂分化标志基因的表达与脂滴的形成。结果:通过对Scramble_A3 vs Scramble的差异基因比较分析,发现参与脂质代谢和脂质生物合成相关基因表达差异最为明显。对123个参与脂质代谢的基因进行聚类分析,发现在成脂诱导过程中明显升高或降低的基因在敲减NOVA1后升高或降低的程度减弱。提示NOVA1参与ADSCs成脂诱导过程中脂质代谢基因的表达调控。进一步对shNOVAl_A3 vs Scramble_A3的差异基因进行通路富集(pathway)分析,发现参与Unfolded Protein Response的基因表达差异最明显,其次是PPAR信号通路。Western blot显示参与UPR信号通路的基因在敲减NOVA1后被激活;激活内质网应激信号抑制ADSCs成脂分化。此外,通过NOVA1结合蛋白预测以及IP结果证实NOVA1能够与PTBP1相互结合,并且ADSCs成脂诱导7天PTBP1表达升高,敲减PTBP1抑制ADSCs成脂分化。4.影响MSCs成脂分化过程中NOVA1基因表达的相关因素方法:采用不同浓度的Pilocarpine和NPY处理ADSCs,在1天、3天时采用Real-time PCR的方法检测NOVA1的表达变化;不同的成脂诱导成分10-6MDEX、0.5mM IBMX、10 μM Insulin、200 μM吲哚美辛、1μM罗格列酮、完全成脂诱导液以及添加10μM PPARy的拮抗剂GW9662的吲哚美辛、罗格列酮、完全成脂诱导液处理ADSCs,在1天、3天、7天时采用Real-time PCR的方法检测NOVA1的表达变化。结果:不同浓度的Pilocarpine和NPY以及DEX和insulin对ADSCs中NOVA1的表达未见影响,IBMX在处理1天时诱导NOVA1表达升高,3天和7天影响不明显;吲哚美辛在诱导3天和7天时可显著促进NOVA1表达升高;而这种促进作用会被GW9662所抑制。研究结论1.ADSCs中表达多种RBPs,在其成脂分化过程中,hnRNPH1、PTBP1、hnRNPH2、RBM38、FOXC2、NOVA1等RBPs表达发生变化,NOVA1变化差异最明显,而NOVA1在ADSCs成骨以及成肌分化过程中表达无显著变化,说明NOVA1在干细胞分化中的表达具谱系特异性;NOVA在脂肪组织中的表达较在其它组织中高。提示NOVA1在脂肪分化中发挥特异性作用。2.NOVA1敲减促进ADSCs凋亡,抑制其迁移。敲减NOVA1抑制ADSCs和BMSCs成脂分化过程中成脂相关基因的表达与脂滴的形成,过表达NOVA1则有促进作用,说明NOVA1参与调控MSCs成脂分化;但单纯过表达NOVA1不能激活MSCs的成脂分化。3.NOVA1通过作用于脂质代谢相关基因以及UPR信号影响MSCs成脂分化,并且NOVA1可能与PTBP1作为复合体发挥作用。4.NOVA1基因启动子区域存在PPARy应答元件,PPARy配体吲哚美辛和罗格列酮能够促进NOVA1的表达,这种促进作用可被PPARγ拮抗剂GW9662抑制,说明PPARy信号通路参与调控NOVA1的表达。