植物化学物(phytochemicals)是指植物来源的、具有生理或药理活性且安全的小分子化合物。根据其结构和功能,大致可分为植物雌激素、类胡萝卜素、植物固醇、卟啉类化合物、含硫化合物、蛋白酶抑制剂、香辛料、萜类及其衍生物、植酸、皂甙等。近年来,利用植物化学物来治疗人类疾病,特别是治疗癌症和心血管疾病,已经日益被公众和科学界所关注。生姜是亚洲,特别是东南亚地区的一种重要栽培植物,我国卫生部将其列为首批公布的药食兼用植物资源之一。植物化学物6-姜酚是生姜中提取出来的酚类物质,是姜酚的主要成分,6-姜酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、强心、降压、降血脂、降血糖、抗凝等多种生物学活性。其中6-姜酚抗肿瘤的作用最受关注。但其确切的机制尚不十分清楚。本研究以人的肝脏肿瘤细胞HepG2细胞为研究对象,探讨6-姜酚对肿瘤细胞的遗传毒性,以及抗肿瘤、抗氧化等生物活性。通过单细胞凝胶电泳(SCGE)试验及微核试验(MNT)检测细胞DNA和染色体损伤,评价6-姜酚的遗传毒性。为探讨其可能的遗传毒性机制,用免疫组化方法检测细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的表达水平,用2’,7’-二氢二氯荧光素(DCFH)和苯二醛(OPT)分别测定细胞内活性氧类(ROS)以及还原性谷胱甘肽(GSH)水平,用吖啶橙(Acridine orange)和罗丹明(Rhodamine 123)分别测定细胞内溶酶体膜稳定性和线粒体膜电位的改变水平。结果显示,6-姜酚(20μM - 80μM)作用于HepG2细胞1 h后,引起DNA链断裂,细胞形成彗星样拖尾现象,且呈剂量依赖关系。6-姜酚(20μM - 40μM)作用于HepG2细胞24 h后,可致细胞微核数量明显增加,并随6-姜酚浓度的增高而增加。此外,6-姜酚(20μM - 80μM)作用于HepG2细胞3 h后,可致8-OHdG的表达升高;作用1 h后,可引起细胞内ROS水平增加、GSH水平下降;作用40分钟后,引起细胞内溶酶体膜稳定性改变;作用50分钟后,引起细胞内线粒体膜电位下降。以上结果说明,6-姜酚对HepG2细胞有遗传毒性作用,其机制可能与氧化应激有关,同时,溶酶体和线粒体可能是6-姜酚造成HepG2细胞毒性的靶器官。上述的实验结果显示,低剂量的6-姜酚不会引起细胞的氧化性损伤,提示低剂量的6-姜酚可能具有文献报道的抗氧化作用,因此我们对低剂量的6-姜酚是否具有氧化作用做了进一步研究。棒曲霉素(patulin, PAT)是由青霉菌、曲霉菌等产生的真菌毒素。普遍存在于果蔬制品尤其在苹果中,在其它食品中也有发现。PAT超标是果汁生产中的一个重大问题,是近年国内外引起重视的生物性食品危害因素之一。世界卫生组织和世界上许多国家将苹果汁中PAT的最高允许浓度定为50μg/L。欧盟也提出了对苹果汁中PAT限量的要求。国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)将PAT对人类的致癌性列为第三类,即现有证据尚不能就其对人类致癌性进行分类。我们在明确了PAT对HepG2细胞具有氧化损伤及遗传毒性的基础上,采用6-姜酚为保护剂,观察低剂量6-姜酚的抗氧化作用。结果显示,10μM的6-姜酚能显著降低PAT所致的DNA链断裂程度,减少PAT诱发的细胞微核形成率。同时,6-姜酚抑制了PAT引起的ROS的生成,同时升高了GSH的水平,并使8-OHdG的水平有所下降。结果证实,6-姜酚对PAT造成的遗传毒性作用有很好的保护作用,其机制主要与6-姜酚具有的抗氧化活性有关。关于6-姜酚抗肿瘤的作用机制尚不十分清楚,其中诱导肿瘤细胞凋亡是其抗肿瘤作用的主要机制之一。在研究6-姜酚遗传毒性时,我们发现溶酶体和线粒体可能是6-姜酚造成HepG2细胞毒性的靶器官,因此我们推测6-姜酚诱发HepG2细胞凋亡是否与溶酶体-线粒体这个途径有关。实验中,我们采用Hoechst 33342荧光染色和TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling)方法,对6-姜酚所致的HepG2细胞凋亡进行了分析。用荧光法检测溶酶体通透性和线粒体的膜电位水平,以及ROS和GSH的生成水平。用Western blot方法分析组织蛋白酶D (cathepsin D)和细胞色素c (cytochrom c)的蛋白表达情况。结果显示,6-姜酚可以引起HepG2细胞的凋亡发生,且溶酶体的通透性改变和线粒体的膜电位水平降低是凋亡发生的早期事件,与此同时,6-姜酚还引起HepG2细胞内的ROS水平显著升高以及GSH水平显著下降,这说明细胞的氧化应激状态可能是引起凋亡发生的机制之一。我们发现cathepsin D在凋亡发生中发挥了重要的作用。6-姜酚作用3 h就从胞浆中检测到了cathepsin D的释放,而在6-姜酚作用于HepG2细胞6 h后,我们才从胞浆中检测到了cytochrom c的释放。为了进一步证明cathepsin D的释放可能是凋亡发生过程中的上游事件,我们应用了cathepsin D的特异性抑制剂pepstatin A,应用pepstatin A后,发现胞浆中几乎检测不到cathepsin D的水平。有趣的是,胞浆中cytochrom c的水平也显著下降,提示溶酶体在6-姜酚诱导的细胞凋亡过程中发挥了重要作用,cathepsin D的释放可能是cytochrom c释放的上游事件。总之,细胞凋亡过程是受细胞内多种酶、细胞因子和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程。我们的研究表明6-姜酚可能是通过“溶酶体-线粒体”轴这个途径诱导HepG2细胞产生凋亡,但6-姜酚是具体通过哪些途径或哪些促凋亡因子引起溶酶体的通透性改变,各个因素之间究竟如何作用还有待于进一步研究。综上所述,本研究的创新之处在于: l.首次发现6-姜酚可引起HepG2细胞细胞的氧化性损伤,造成遗传毒性的发生。2. 10μM的6-姜酚具有抗氧化作用,对PAT的细胞毒作用具有防护作用,减轻其氧化损伤及遗传毒性。3.提出6-姜酚可能通过“溶酶体-线粒体”轴,诱发HepG2细胞凋亡的发生。