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外生菌根对重金属具有较高的耐受能力和吸附能力,是进行重金属生态修复的有效途径之一。在前期实验证明,外生菌根真菌在重金属胁迫下能分泌大量具有重金属结合能力的蛋白的基础上,本研究假设,外生菌根真菌与植物结合后,具有分泌固定重金属的耐热蛋白的能力,且该种蛋白可能与被证实具有较强的重金属固持能力的丛枝菌根分泌的球囊霉素,具有相似的特性。 研究选择外生菌根真菌Xerocomus chrysenteron作为被试菌种,中国主要针叶树种油松(Pinus tabularformis)作为被试植物,研究菌根真菌接种油松分泌耐热蛋白的能力与特点;选择中国主要污染重金属铜(Cu)和镉(Cd)作为研究对象,分析接种油松在两种重金属过量胁迫下,根际分泌物中蛋白质的种类和对重金属的结合能力。 研究结果表明:外生菌根真菌接种油松分泌耐热蛋白质的含量随着时间发生显著性变化,在第四周达到最大值,每立方厘米培养基质中含有:总耐热蛋白(TTP)为23.43μg,易提取蛋白量(EETP)为21.52μg。 在没有胁迫的环境条件下,接种并没有引起根系分泌物中耐热蛋白量的变化,接种和未接种油松根际中耐热蛋白质含量之间,并没有显著差异。从绝对量来看,球囊霉素只占耐热蛋白质含量的1％左右,含量极其微少,且在接种与未接种油松中没有显著性差异,这表明,外生菌根分泌的耐热蛋白,与内生菌根分泌的球囊霉素,具有很大的差异。分别对菌丝分泌物和接种根系分泌物的耐热蛋白进行MALDI-TOF/TOF-MS测定,发现蛋白组成不同。真菌菌丝分泌蛋白主要由肌动蛋白gi|13307组成,未接种油松没有检测到该耐热蛋白,接种油松分泌的耐热蛋白主要是由gi|4501883,gi|288300146组成,确定这三种蛋白质的主要氨基酸序列都为“K.QEYDESGPSIVHR.K”,表明外生菌根真菌及接种油松分泌的耐热蛋白具有同源性。 铜胁迫下,接种促进了油松分泌耐热蛋白质的能力。油松蛋白分泌量随着铜浓度的增加有显著性差异,铜浓度为50 ppm时,接种油松分泌蛋白能力达到最大值:TTP,43.7 mg/g;EETP,40.8 mg/g,是非接种的油松分泌能力的2.91倍。铜胁迫下菌丝分泌物、接种菌根和未接种菌根中蛋白质的组成与无铜处理的相同。接种油松分泌的耐热蛋白(TTP)gi|288300146最大可以固定处理铜浓度的3.43％,约为未接种油松固持量(最大1.37％)的2.5倍。 镉胁迫下,接种油松分泌耐热蛋白的能力显著大于未接种油松的分泌能力。镉浓度为0.75 ppm,接种油松分泌能力达到最大值,分别为TTP44.01 mg/g,EETP41.02 mg/g,约为非接种油松分泌能力的5.0倍。MALDI测定结果表明镉胁迫并没有改变接种菌根和未接种菌根中蛋白质的组成,但改变了菌丝分泌物中蛋白质的组成。与铜胁迫下相同,接种油松分泌的分子量为31 kDa的耐热蛋白,其主要由肌动蛋白gi|288300146组成:而外生菌根真菌分泌的分子量为31kDa的耐热蛋白,其主要由肌动蛋白gi|115386236,gi|116198005组成,确定这3种蛋白性质的主要氨基酸序列一致,有两条“K.QEYDESGPSIVHR.K”和“K.SYELPDGQVITIGNER.F”,其中特异性氨基酸序列为“K.QEYDESGPSIVHR.K”。这表明,镉胁迫条件下,外生菌根真菌及接种油松分泌的耐热蛋白具有同源性,其专一性氨基酸序列为“K.QEYDESGPSIVHR.K”。接种油松分泌的耐热蛋白(TTP)固定重金属的能力显著大于未接种油松的固定能力。同时,实验结果显示接种油松根内固定量显著大于未接种油松,证明接种条件增加了植物根系中镉的含量。 铜、镉,作为植物生长的必要和非必要元素,对外生菌根真菌及接种油松的影响有一定差异性。二者促进接种油松分泌耐热蛋白的能力显著增加。不同重金属胁迫下,外生菌根真菌及接种油松分泌的耐热蛋白质氨基酸序列片段发生改变,但仍然属于同源蛋白质。 本研究首次确定了外生菌根真菌X.chrysenteron及接种油松分泌耐热蛋白质的种类,并研究不同重金属胁迫条件下,菌根分泌耐热蛋白的含量,结构,及固定重金属能力的变化。