本论文分为四部分。第一部分为文献研究,第二部分为基于药物体系的柴金方药物制备工艺研究,第三部分为柴金方质量控制体系研究,第四部分为论文总结与讨论。第一部分文献研究本部分概述了中药复方有效物质基础的研究进展,综述了柴金方中各单味药柴胡、郁金、佩兰、何首乌和肉桂的主要化学成分、药理活性以及体内代谢的研究概况,共引用文献116篇,以此指导本课题工作的开展。第二部分基于药物体系的柴金方药物制备工艺研究基于前期药物体系研究结果,以药物体系导向确定柴金方抗抑郁药物制备重点为萜类及酚类,研究建立其药物制备工艺与质量控制方法,以此探索建立中药有效物质基础发现新模式。(1)基于药物体系建立了柴金方药物提取工艺。采用水蒸气蒸馏法对柴金方饮片(除制首乌外)进行挥发油(单萜及其倍半萜类所在部位)提取工艺研究,以出油量为指标,对浸泡时间(E)、加水量(F)、提取时间(G)进行考察。结合实际生产,确定柴金方第一步挥发油的最佳提取工艺条件为:柴金方饮片(除制首乌外)加F2倍量的水,浸泡E3小时,水蒸气蒸馏提取G4小时。采用正交设计L9(34)试验方法,以正交提取物中萜类含量和酚类含量为指标,对提取溶剂(A)、溶剂倍量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4个因素进行考察。综合正交提取物中萜类含量和酚类含量,并结合实际生产,确定柴金方最佳正交提取工艺条件为:A3B2C3D2,即柴金方挥发油提取工艺的药渣与制首乌饮片合并,加B2倍量A3溶剂加热回流提取D2次,每次C3小时。(2)基于药物体系建立了柴金方药物富集工艺。以萜类和酚类的吸附量和吸附-解吸率为考察指标对树脂类型进行筛选。通过测定6种不同类型的大孔吸附树脂对萜类和酚类的吸附特性,分析得出H2型大孔吸附树脂对萜类和酚类有较大吸附量,较容易解吸附,吸附后富集物中萜类和酚类的含量较高,最终选择H2型大孔吸附树脂作为富集柴金方药物的树脂。然后,以洗脱物中萜类和酚类的含量及其转移率为主要考察指标对H2型大孔吸附树脂富集工艺进行研究,分别对其吸附条件、除杂条件、洗脱条件进行优化,包括上样液浓度、上样量与树脂体积比、树脂柱径高比、吸附流速、最大上样量;水洗倍量、水洗流速;洗脱溶剂、洗脱流速、洗脱倍量等参数的考察,确定最佳富集工艺为:柴金方按最佳工艺提取后,提取液回收溶剂,真空干燥,将柴金方提取物水分散液(相当于I3 g/mL生药材)上样,经过H2型大孔树脂,使得饮片量与树脂体积比为K3 g:1mL,树脂径高比为L2,吸附流速为M2 BV/h,上样后用P2BV水洗除杂,除杂流速为Q2 BV/h,再以R3%乙醇洗脱U1BV,洗脱流速为S2 BV/h,收集R3%乙醇洗脱物,浓缩,真空干燥,即得柴金方酚类富集物。再以R7%乙醇洗脱V4BV,洗脱流速为S2 BV/h,收集R7%乙醇洗脱物,浓缩,真空干燥,即得柴金方萜类富集物。(3)对基于药物体系的柴金方药物制备工艺进行了验证。3批样品的制备和含量测定结果表明,挥发油得率平均为0.32%(ml/g);萜类、酚类可以被较完全的提取(萜类平均提取率为86.53%,酚类平均提取率为91.05%),其平均含量分别为0.50%和6.09%;柴胡皂苷B2和二苯乙烯苷的平均提取率为81.42%和92.21%,其平均含量分别为0.2384%和 1.2456%。萜类富集物平均出膏率为1.00%,萜类成分在萜类富集物中平均含量为7.60%,其平均转移率为81.17%;酚类富集物平均出膏率为3.85%,酚类成分在酚类富集物中平均含量为16.04%,其平均转移率为57.75%,在萜类富集物中平均含量为12.28%,其平均转移率为11.64%。就其指标性成分而言,柴胡皂苷B2在萜类富集物中平均含量为3.68%,平均转移率为77.31%;二苯乙烯苷在酚类富集物中平均含量为3.47%,平均转移率为60.44%。柴金方酚类、萜类富集工艺合理、稳定。(4)采用利血平复制抑郁模型造模,盐酸氟西汀为阳性对照药,小鼠游泳实验、悬尾实验及小鼠利血平拮抗实验显示,柴金方富集物、醇提物、水提物均有抗抑郁作用,其中柴金方富集物的抗抑郁作用最为显著(P<0.01)。结合神经递质指标的测定数值,可以得出柴金方富集物的抗抑郁作用优于醇提物更优于水提物。给予等同生药量,柴金方富集物的用量(萜类富集物出膏率为1.00%,酚类富集物出膏率为3.85%)明显少于醇提物(出膏率为18.24%)和水提物(出膏率为27.10%),可避免因用药剂量过大带来的副作用。(5)对柴金方药物制备物进行了质量表征研究。柴金方富集物较提取物有药效和服用量上的优势,发现以柴胡皂苷B2为代表的萜类成分在发挥抗抑郁疗效上作用更显著,在药物制备工艺及质量控制中,应尤为关注影响萜类成分及其指标成分柴胡皂苷B2的相关因素,从而以药物体系与柴金方制备物质量表征关联分析结果为导向,指导和评价药物制备工艺与质量控制,对药物应用具有指导意义,为药物创新提供新的思路。第三部分 柴金方药物质量控制体系研究(1)采用HPLC法,建立了柴金方药物中萜类及萜类指标性成分柴胡皂苷B2的含量测定方法。以柴胡皂苷B2为对照品计算回归方程为:y=1742644 x-20112,r=0.9999(n=8),表明柴胡皂苷B2在0.072μg～3.60μg范围内与峰面积线性关系良好,平均加样回收率为100.89%,RSD=2.22%(n=6)。测得柴金方提取物中柴胡皂苷B2的含量为0.2367%～0.2395%之间,柴金方萜类富集物中柴胡皂苷B2含量为3.4091%～3.8758%之间。以柴胡皂苷B2为对照品,计算与柴胡皂苷B2有相同光谱图的一类成分峰面积之和,即作为萜类成分的峰面积,求得其含量,此方法弥补了单一用柴胡皂苷B2的含量质控不足以反映一大类(萜类)的情况。测得柴金方提取物中萜类的含量为0.47%～0.53%之间,柴金方萜类富集物中萜类含量为6.91%～8.09%之间。3批样品的萜类的含量测定结果表明,该方法准确简便且稳定,可作为柴金方药物中萜类及其指标性成分柴胡皂苷B2的含量测定方法。(2)采用可见分光光度法,建立了柴金方药物中酚类的含量测定方法,并用三氯化铁-铁氰化钾显色法进行了方法学考察。以二苯乙烯苷为对照品,计算回归方程为y=623.62x+0.1442,r=0.9987(n=9),表明二苯乙烯苷在 0.2410ug/ml～1.2048ug/ml 的浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系,二苯乙烯苷平均加样回收率为99.98%,RSD=2.28%(n=6)。测得柴金方提取物中酚类的含量为6.00%～6.18%之间,柴金方酚类富集物中酚类含量为15.12%～16.69%之间,柴金方萜类富集物中酚类含量为11.22%～13.31%之间。3批样品的酚类含量测定结果表明,该方法准确简便且稳定,可作为柴金方药物中酚类的质量控制方法。(3)采用HPLC法,建立了柴金方药物中酚类指标性成分二苯乙烯苷的含量测定方法。以二苯乙烯苷为对照品,计算回归方程为y=2735220 x-249318,r=0.9996(n=6),表明二苯乙烯苷在0.20μg～4.00μg范围内与峰面积线性关系良好,二苯乙烯苷平均加样回收率为99.25%,RSD=2.92%(n=6)。测得柴金方提取物中二苯乙烯苷的含量为1.2243%～1.2622%之间,柴金方酚类富集物中二苯乙烯苷含量为3.1578%～3.6419%之间。3批样品的酚类指标性成分的含量测定结果表明,该方法准确简便且稳定,可作为柴金方药物中酚类指标性成分二苯乙烯苷的质量控制方法。第四部分 论文总结与讨论(1)基于药物体系建立了柴金方提取和富集的制备工艺方法依据药物体系,结合各单味药自然属性设计柴金方药物制备工艺,并进行了制备物药效学验证,说明柴金方富集物有抗抑郁作用明显,用量少的优势。制备物质量表征发现,以柴胡皂苷B2为代表的萜类成分在发挥抗抑郁疗效上作用更显著,因此在富集工艺中优先保证萜类成分。(2)建立了柴金方药物质量控制体系采用可见分光光度法和HPLC法,分别建立了柴金方药物中萜类和酚类及其指标性成分柴胡皂苷B2和二苯乙烯苷的含量测定方法,作为柴金方药物质量控制方法。柴金方药物的化学类型和指标成分关联药物体系,为创新药物的研发,制定科学、合理、严格的质量控制评价体系提供了新思路。