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丝状真菌(Filamentous fungi)有非常强的蛋白分泌能力,相比于大肠杆菌等原核表达系统和酵母,丝状真菌具有独特的特点和优势。黑曲霉表达异源蛋白具有胞外分泌率高、表达量大、蛋白具有天然活性和蛋白修饰模式接近高等真核生物等优点。黑曲霉作为细胞工厂,广泛应用于酶制剂、异源蛋白、有机酸等生产领域。被美国FDA和世界卫生组织认定为一般认为安全可靠无毒的(Generally regarded as safe,GRAS)微生物。脂肪酶是非水相酶学中最为重要的一类酶,与在水相体系中的水解反应特性显著不同,脂肪酶在非水相体系中具有良好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性。该特性使脂肪酶可被广泛地应用于生物能源(生物柴油)、药物合成等应用前景广阔的领域。细胞表面展示技术在全细胞催化剂制备、蛋白质文库筛选、蛋白质定向进化、高亲和性抗体分选、抗原/抗体库构建、亲和力成熟、疫苗的生产、免疫生物催化和生物传感器等多个领域得到发展和应用。本实验室在酵母细胞展示的基础,创新地在无孢黑曲霉SH-1上实现了表面展示技术。从头构建黑曲霉表面展示脂肪酶体系,并应用于磷脂改性。具体研究如下,(1)使用一种组成型启动子,甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(gpdA-promoter),成功构建无孢黑曲霉细胞表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CALB),并且命名为AN-GpdA-CALB-CwpA。相较于使用诱导型启动子糖化酶基因启动子(glaA-promoter)提高了表面展示的菌体细胞展示酶活与产酶量。(2)运用木糖作为一种非葡萄糖类碳源发酵AN-GpdA-CALB-CwpA,相较于葡萄糖碳源,具有菌体酶活高、生物量大和产酶量大等优点。最高菌体展示酶活达到1100U/g干菌体,最大干重达到22g/L发酵液。(3)利用纤维素水解物作为碳源发酵AN-GpdA-CALB-CwpA。无孢黑曲霉SH-1表面展示CALB可以利用纤维素水解物,且生长良好,比单纯使用葡萄糖获得更多的生物量;其展示的CALB脂肪酶能够表现出较高的菌体酶活和单位体积总酶活。最高菌体展示酶活达到600U/g干菌体,最大干重达到35g/L发酵液,最大产酶量达到36U/ml发酵液。发酵液制备全细胞催化剂可以用于磷脂改性,L-α-甘油磷脂酰胆碱(GPC)产率达到92.8%。