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病毒侵染能够干扰和破坏寄主植物的正常生理生化途径,引起宿主发生相应的病理反应,最终造成农作物减产或绝收。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是目前世界上最普遍、分布最广、危害最为严重的植物病毒之一。CMV在自然界的传播侵染经常伴有卫星RNA的发生,目前发现的大多数辅助卫星RNA都会改变CMV引起的寄主症状。26基因是CMV的致病决定因子,编码一种沉默抑制蛋白,干扰并破坏宿主对病毒侵染的防御体系。microRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于动植物体内的内源性非编码单链小分子RNA,可通过与靶标mRNA的序列互补从而在转录后水平上调控其翻译进程。目前已经发现,miRNAs参与植物多种生理和代谢过程,包括构建病毒防御体系和调控植物生长发育。然而miRNAs在病毒侵染导致植物症状产生这一过程中发挥的作用还未完全研究清楚,这很大程度上是由于miRNAs分子量小检测困难以及大量miRNAs仍处于未知状态,另一方面则可能是由于不同种的病毒寄主响应的机制不同。
本论文采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative RT-PCR)技术,研究了CMV国际标准株系CMV-Fny、致病因子2b缺失突变体CMV-Fny△2b、添加致强卫星sat335的CMV-Fny-satT1以及从北京菊花中分离得到的番茄不孕病毒TAV-Bj这四种病毒侵染番茄后,寄主根、茎组织中miRNAs及其靶标mRNAs表达量的特异性变化,结合CMV病毒各基因(亚)组表达量的差异变化情况,探讨CMV致病决定子2b蛋白以及其寄生因子satT1干扰寄主miRNAs沉默途径的作用,从病毒基因表达量和寄主miRNAs及其靶标mRNAs表达量方面来分析病毒侵染导致寄主症状产生的原因。
本研究结果显示,在CMV-Fny△2b侵染的番茄各营养器官中,病毒各基因(亚)组的表达量均极低,基本维持在10-4-10-6之间;添加卫星satT1后,在番茄各营养器官中CMV-Fny各基因(亚)组的积累量总体趋势是呈现不同程度的降低,但由于病毒粒子在寄主体内运输及扩散,在叶组织中会直接降低,而在茎组织中会出现先升后降,在根系组织中则会出现表达量下降的延迟。在四种病毒处理的番茄根系发育过程中,总体来说CMV-Fny和CMV-Fny△2b的侵染对番茄侧根发育的影响较小,而CMV-Fny-satT1和TAV-Bj对番茄侧根发育造成了严重影响,表现为NAC1相对表达量的降低和侧根数量的大幅度减少;而在所有处理组中,CMV-Fny△2b处理组的主根发育最长。在茎组织的发育过程中,我们则清楚的看到在接种21天后的CMV-Fny-satT1处理组中茎木髓部出现了明显异常,表现为茎中空。而在miRNAs和靶标的检测中,我们发现TAV-Bj和CMV-Fny-satT1侵染的番茄茎中miR164的含量均偏高,而靶标NAC1的含量都明显偏低。在实验中,我们还发现在病毒侵染前3周,miR156a在感病番茄茎组织中的表达量呈显著性大幅度上升,与此同时在病毒处理组番茄根组织中miR159呈显著性大幅度上调表达,而此周期内病毒粒子的活性最强,我们推测这两种miRNAs可能与病毒在不同组织的侵染相关。本研究还发现病毒的侵染干扰了寄主番茄营养器官中miRNAs和靶标mRNAs的表达。寄主番茄对不同病毒具有不同的响应,一般来说,这种响应与病毒的致病性和病毒种类相关。以上研究结果证实在病毒-寄主互作过程中,病毒利用miRNAs调控途径实现对寄主基因表达的调控,并导致了相应症状的产生,该研究也为揭示卫星对CMV致病性影响的关系、植物miRNAs及其靶标mRNAs与病毒侵染的关系提供了一些理论依据。