上皮性卵巢癌起源于一系列表观遗传和基因改变,这些变化促使原癌基因激活,抑制抑癌基因活性,导致疾病发生和进展。近20年来,肿瘤治疗不断发展,但是卵巢癌的5年生存率仍徘徊于30%～40%,因此寻找和探究与卵巢癌发生、发展密切相关的关键靶点以及潜在靶向治疗药物具有非常重要的意义和必要性。迄今为止,针对上皮性卵巢癌发病机制的研究中仍存在关键节点需要被进一步探索和考证。在过去的二十年中,鞘磷脂代谢物已经被证明能够在多种恶性肿瘤的发生发展中起关键性调控作用,研究发现针对鞘磷脂代谢通路中关键因子的靶向药物能在肿瘤治疗中发挥显著疗效。细胞内鞘氨醇-1-磷酸（Sphingosin-1-phosphate,S1P）的生成由鞘氨醇激酶（Sphingosine kinase,Sph K）等调控。在哺乳动物体内,Sph K包括两种亚型Sph K1和Sph K2。目前关于Sph K2在肿瘤中的作用的报道中存在不一致的观点。在部分研究中发现Sph K2对肿瘤发展起抑制作用;与此相反,在黑色素瘤、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、结肠癌、肺癌、肾癌等恶性疾病中Sph K2能促进肿瘤细胞增殖,同时抑制细胞凋亡,对肿瘤发展起促进作用,并且针对Sph K2的药物在临床前研究中显示出比靶向Sph K1更为强大地抑瘤作用。这些研究结果促使我们去了解Sph K2在上皮性卵巢癌中的扮演的角色,它在上皮性卵巢癌中的表达情况以及对疾病发展的影响和机制。在本课题中,我们从临床病例资料出发,结合体外和体内研究,探索了Sph K2对上皮性卵巢癌增殖及凋亡的影响及其潜在的调控机制,为上皮性卵巢癌的临床诊断、治疗和预后评估提供了新的线索。本课题分为四个部分:（1）Sph K2在上皮性卵巢癌原发灶中及细胞系中的表达情况以及Sph K2表达与临床特点和预后的关系;（2）Sph K2对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响和机制研究;（3）ABC294640对上皮性卵巢癌增殖、凋亡调控作用及机制研究;（4）在调控Sph K表达的上游信号转导通路中卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone,FSH）调控卵巢癌增殖及其可能机制研究。研究目的:（1）研究Sph K2在上皮性卵巢癌（原发灶）、上皮性卵巢囊肿、正常卵巢上皮组织和卵巢癌细胞系中蛋白表达情况及Sph K2与卵巢癌患者临床特点和预后的关系。（2）探讨Sph K2对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡的调控作用及相关机制。（3）探讨Sph K2特异性抑制剂ABC294640对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡的调控作用及相关机制。（4）探索Sph K、S1PR在FSH介导的上皮性卵巢癌细胞增殖促进作用中扮演的角色以及其可能机制。研究方法:（1）免疫组化方法检测在上皮性卵巢癌、上皮性卵巢囊肿和正常卵巢上皮组织中的Sph K2蛋白表达情况;用Westernn blot检测正常卵巢上皮细胞和上皮性卵巢癌细胞系中Sph K2表达情况。比较Sph K2在卵巢癌和正常卵巢上皮细胞中的表达差异,分析Sph K2的表达情况与卵巢癌患者临床特点与预后的关系。（2）针对序列设计了特异性sh RNA和阴性对照sh RNA分别转染SKOV3和HO8910细胞。通过CCK-8法和克隆形成实验观察细胞增殖能力变化。流式细胞仪分别检测下调Sph K2表达前后细胞周期和细胞凋亡情况变化。通过裸鼠皮下瘤模型检测细胞中下调Sph K2表达后对皮下移植瘤生长情况的影响。并用Western blot检测了与细胞周期密切相关的Cyclin D1、PRb和Cyclin B1的表达以及与凋亡密切相关的Cleaved-caspase 3、Bcl-2的表达情况变化。通过Western blot和免疫组化检测C-MYC表达情况以初步探讨Sph K2对卵巢癌增殖调控的可能机制。（3）将Sph K2抑制剂ABC294640作用于SKOV3和HO8910后,通过CCK-8法和克隆形成观察细胞增殖能力变化。流式细胞仪分别检测药物作用前后细胞周期和细胞凋亡情况变化。通过裸鼠腹腔移植瘤模型考察了ABC294640对卵巢癌生长情况的影响。并用Western blot检测与细胞周期密切相关的蛋白以及与凋亡密切相关的蛋白表达情况变化。通过Western blot和免疫组化检测C-MYC表达情况以初步探讨Sph K2对卵巢癌生长调控的可能机制。（4）将Sph K抑制剂（SKI-II）和FSH分别单独或联合作用于卵巢癌细胞,通过CCK-8和克隆形成观察细胞增殖能力变化。用Western blot分别检测单加入FSH或者抑制ERK通路再加入FSH处理后卵巢癌细胞中p Sph K1和p Sph K2表达变化。用si RNA干扰Sph K1和Sph K2表达后,CCK-8法检测加入FSH后卵巢癌细胞增殖变化情况,并用Western blot检测ERK和AKT磷酸化变化情况。用si RNA干扰S1PR表达后,CCK-8法观察加入FSH后卵巢癌细胞增殖变化情况,并用Western blot检测ERK和AKT磷酸化变化情况。研究结果:（1）上皮性卵巢癌患者中Sph K2蛋白表达水平显著高于良性上皮性卵巢囊肿和卵巢正常上皮组织。在上皮性卵巢癌中,FIGO分期III-IV期患者肿瘤组织中Sph K2蛋白表达水平显著高于I-II期。Sph K2在病理分级为高级别、存在淋巴结转移、有术后残留病灶及有腹水生成患者中表达水平较高。在卵巢癌中,Sph K2高表达与患者预后不佳相关。在卵巢癌细胞系中Sph K2表达水平高于正常卵巢上皮细胞。（2）在SKOV3和HO8910细胞中,Sph K2沉默后通过CCK-8法及克隆形成实验提示细胞增殖能力下降。在SKOV3和HO8910细胞中,Sph K2 sh RNA转染组细胞中S期细胞比例显著下降,细胞中Cyclin D1、Cyclin B1和PRb蛋白的表达水平明显下降。在SKOV3和HO8910细胞中,转染组凋亡细胞比例轻微上升,但是细胞中Cleaved-caspase 3、Bcl-2表达水平无明显变化。体内实验中,Sph K2 sh RNA干扰组中裸鼠皮下移植瘤生长受抑制,肿瘤生长速度以及肿瘤体积和重量都低于对照组。干扰Sph K2表达后,SKOV3和HO8910细胞中C-MYC蛋白表达水平均明显低于未转染组细胞和阴性对照细胞株。（3）ABC294640能有效抑制SKOV3和HO8910增殖和克隆形成能力。在SKOV3和HO8910细胞中,ABC294640作用后细胞中S期细胞比例均显著下降。ABC294640作用后细胞中Cyclin D1,Cyclin B1和P-Rb蛋白的表达水平呈剂量依赖性下降。在SKOV3和HO8910细胞中,ABC294640作用后凋亡细胞比例显著上升,细胞中Cleaved-caspase 3表达水平明显上升,而Bcl-2表达水平下降。ABC294640作用后,能通过增加C-MYC降解抑制C-MYC蛋白表达。在裸鼠腹腔移植瘤模型中,与对照组比较,ABC294640能明显抑制肿瘤生长,腹腔移植瘤数量和重量均显著减小。（4）FSH能通过ERK1/2激活Sph K促进卵巢癌细胞增殖。Sph K1、Sph K2、S1PR1和S1PR3通过对ERK1/2和AKT通路调节参与FSH对卵巢癌的增殖促进作用。结论:（1）Sph K2在上皮性卵巢癌中表达水平增高。高表达患者预后较差。Sph K2高表达可能与上皮性卵巢癌发病和进展有关。（2）有效地沉默Sph K2表达后导致细胞周期阻滞进而抑制上皮性卵巢癌增殖,其机制可能是通过下调Cyclin D1、P-Rb和Cyclin B1蛋白表达水平引起的。抑制Sph K2能抑制C-MYC蛋白表达导致上皮性卵巢癌生长速度下降。（3）在上皮性卵巢癌中,Sph K2特异性抑制剂ABC294640能同时引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡进而有效抑制上皮性卵巢癌细胞生长。ABC294640对肿瘤的生长抑制作用可能是通过加快C-MYC降解从而下调C-MYC蛋白表达水平实现的。ABC294640在卵巢癌的治疗中具有良好的应用潜能。（4）FSH通过ERK1/2刺激Sph K1和Sph K2磷酸化增加,进一步通过S1PR（S1PR1和S1PR3）途径实现对上皮性卵巢细胞的增殖促进作用,并且此增殖促进作用可能是通过调控ERK和AKT磷酸化实现的。