辣椒素影响神经胶质瘤细胞自噬的机制及意义研究

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目的:探讨神经胶质瘤中辣椒素与自噬的作用及关系及其作用机制和临床意义。方法:1.应用免疫组化ElivisionTMplus法检测151例人不同级别神经胶质瘤组织(实验组)和20例水肿脑组织(对照组)中的自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3B和mTOR蛋白的表达情况;并分析上述因子与胶质瘤患者与临床病理参数及预后(整体生存期、无瘤生存期)之间的关系。2.实验分组1:分别用自噬诱导剂雷帕霉素(对照组)、辣椒素及雷帕霉素+辣椒素联合处理人胶质母细胞瘤T98G和人星形细胞瘤U373细胞株,观察自噬相关蛋白SQSTM1/p62和Beclin1在各组中表达水平的差异。3.实验分组2:构建抑制自噬的mTOR表达质粒,将实验分为(1)空白对照组(2)空载体组(3)mTOR过表达组(4)辣椒素组(5)mTOR过表达+辣椒素组。运用Lipofectamin3000试剂盒瞬时转染T98G和U373细胞株,CCK-8试剂盒检测上述各组细胞的增殖情况的差异;qRT-PCR检测上述各组细胞的mRNA水平差异;WB检测上述各组中自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3B、ATG5和Beclin1表达水平的差异。结果:1.免疫组化结果显示:自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3B在高级别神经胶质瘤中的表达较高,在低级别神经胶质中的表达较低;而自噬抑制蛋白mTOR在高级别神经胶质瘤中的表达较低,在低级别神经胶质中的表达较高;2.Speraman统计分析结果显示:LC3B、SQSTM1/p62和mTOR均与患者总体生存期和无瘤生存期有显著相关性(P<0.05),LC3B、SQSTM1/p62蛋白高表达的患者总体生存期及无瘤生存期均显著低于LC3B、SQSTM1/p62蛋白低表达患者;而mTOR蛋白高表达患者的总体生存期及无瘤生存期均显著高于mTOR蛋白低表达患者;3.WB结果显示:辣椒素和自噬诱导剂雷帕霉素处理T98G和U373细胞时,SQSTM1/p62和Beclin1蛋白表达均升高,提示辣椒素与雷帕霉素具有协同作用;4.CCK8细胞动力和WB结果显示:辣椒素可致胶质瘤细胞增殖能力减弱,并伴随自噬相关蛋白SQSTM1/p62、ATG4B、ATG5、Beclin1表达升高和mTOR蛋白表达降低;过表达mTOR可致胶质瘤细胞增殖能力增强,并伴随自噬相关蛋白SQSTM1/p62、ATG4B、ATG5和Beclin1表达降低;mTOR过表达+辣椒素组相较于空白对照组,自噬蛋白SQSTM1/p62、ATG4B和ATG5表达升高,Beclin1、mTOR表达降低。5.qRT-PCR结果显示:辣椒素处理后SQSTM1/p62、Beclin-1、ATG5和LC3-ⅡmRNA水平均显著升高;mTOR过表达质粒组SQSTM1/p62、Beclin-1、ATG5和LC3-ⅡmRNA水平均显著降低;mTOR过表达+辣椒素组SQSTM1/p62 mRNA表达水平相较于空白对照组降低,Beclin-1、ATG5和LC3-ⅡmRNA表达水平显著升高。以上结果提示辣椒素可能是通过mTOR发挥作用。结论:1.自噬可能与人神经胶质瘤的恶性进展有关;2.辣椒素是一种自噬诱导剂;3.辣椒素可能是通过mTOR位点发挥协同自噬的作用。
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