目的:研究“补肾健脾,填精益髓”针法对APP/PS1双转基因小鼠（经典阿尔茨海默病模型）学习记忆能力以及对小鼠脑海马Aβ、Tau蛋白表达和形态损伤的干预作用;进一步从炎症因子IL-1β、IL-10、TNF-α和LPS表达以及肠道菌群及代谢改变探讨针刺改善阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的机理,为针灸干预AD的理论研究和临床应用提供依据。材料与方法:1.针灸治疗AD的临床选穴规律总结文献检索近八年来在CNKI、Pub Med中发表的有关针灸治疗阿尔茨海默病的临床文献,检索范围为2013年1月1日-2021年1月1日。运用“中医传承辅助平台”软件和SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析,总结针灸治疗AD的临床选穴规律并探讨基于脑肠轴理论运用“补肾健脾,填精益髓”针法治疗AD的取穴处方。2.基于肠道菌群及其代谢改变探讨针刺APP/PS1小鼠干预阿尔茨海默病的机理2.1材料选择APP/PS1双转基因小鼠24只,随机分为针刺治疗组8只,模型对照组8只,阳性药对照组8只,同期相同条件下饲养C57BL/6野生小鼠6只作为正常对照组,共4组。2.2方法2.2.1各组干预方法正常对照组:同等饲养条件下不做任何处理,但在其他各组进行干预时抓取一次,并用自制鼠板固定,以保证干预条件相同,每日1次,每次20min,共治疗4周,每周干预5日,休息2日。AD模型组干预方法同正常对照组。阳性药对照组:盐酸美金刚片按20mg/kg剂量灌胃给药,每日1次,共治疗4周,每周干预5日,休息2日。针刺治疗组:选取小鼠头部百会穴,背部的肺俞、脾俞、肾俞,上肢部的合谷、下肢部的足三里和三阴交进行治疗,20min/次,每日1次,针刺5日,休息2日,治疗4周。2.2.2 Morris水迷宫实验（MWM）水迷宫实验分为两部分,分别是隐藏平台训练实验和空间探索实验,一共需要5天。在本研究中,首先进行4天的水迷宫隐藏平台训练实验。然后第五天进行空间探索实验,实验1天。最终整理数据评估针刺对AD小鼠空间学习和记忆能力的影响。2.2.3检测指标及方法于水迷宫实验后取小鼠脑组织、血清、肠内容物置于-80℃冰箱保存备检。2.2.3.1海马区病理切片制备采用苏木精-伊红（HE）染色制作小鼠脑海马区组织病理切片。2.2.3.2小鼠海马区β淀粉样蛋白（Aβ）和Tau蛋白检测采用免疫印迹（Western blot,WB）依次检测分析海马区Aβ和Tau蛋白表达,以β-actin为内参。依次进行组织蛋白提取、样品制备、电泳、分析。2.2.3.3小鼠血清炎症因子水平检测采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked Immuno sorbent Assay,ELISA）,按照试剂盒步骤检测小鼠炎症因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF-α）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）水平。2.2.3.4小鼠肠内容物微生物表达检测采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒对肠内容物样本进行总DNA抽提和质控,之后用16Sr DNA基因组学技术检测小鼠肠内容物中的肠道菌群表达,分析α多样性、β多样性、组间菌群表达差异;使用PICRUSt2分析工具,对其物种功能进行预测和分析;基于Spearman相关性分析肠道菌群与炎症因子的相关性。2.2.3.5小鼠粪便代谢物分析通过液相色谱和质谱联用对小鼠的代谢产物进行了非靶向研究。使用MetaboAnalyst5.0在线分析工具筛选并分析差异代谢物及代谢通路,基于Spearman相关性分析肠道菌群与重要通路上代谢物的相关性。2.3统计方法:结果应用SPSS 20.0统计学软件进行分析。结果:1.针灸临床治疗AD的取穴规律近八年来临床上应用针灸临床治疗AD使用频次最多的腧穴依次为百会、风府、大椎等;取穴所属经脉主要集中于督脉和足太阳膀胱经;取穴部位集中于头颈部;选取的特定穴集中于交会穴和五输穴;穴位配伍中以百会配大椎最为常用。2.“补肾健脾,填精益髓”针法可能改善了APP/PS1小鼠的学习记忆能力2.1“补肾健脾,填精益髓”针法可能改善了APP/PS1小鼠空间学习能力前四天进行水迷宫隐藏平台实验,观察“补肾健脾,填精益髓”针法对APP/PS1小鼠空间学习能力的影响。在训练第一天,各组小鼠都较难找到平台,但在第四天,它们基本都能够很快找到平台,路径也越来越短;正常对照组和针刺治疗组小鼠到达平台的路径最短,模型组小鼠到达平台的路径最长、最复杂。各组小鼠的逃避潜伏期随着训练时间的增加而减小。而且,在训练第3天显著缩短,在训练的第三天和第四天,针刺组小鼠对平台的逃避潜伏期与正常对照组最接近。各组找到目标象限平台的距离随着训练次数的增多而逐渐减小,但寻找平台的平均速度没有明显变化。2.2“补肾健脾,填精益髓”针法可能改善了APP/PS1小鼠空间记忆能力第五天进行水迷宫空间探索实验,观察“补肾健脾,填精益髓”针法对APP/PS1小鼠空间记忆能力的影响。在经过了四天的训练后,小鼠基本能够快速地找到目标象限,模型组逃避潜伏期最长,高于正常对照组（P＜0.05）,差异具有统计学意义;针刺组的逃避潜伏期与模型组和正常对照组差异无统计学意义,但针刺组的逃避潜伏期更接近正常对照组。小鼠游泳的平均速度、通过目标象限的频率、在目标象限游泳时间百分比、路程百分比均与逃避潜伏期的结果相似。针刺组的上述指标与模型组相比更接近正常对照组和阳性药对照组。3.“补肾健脾,填精益髓”针法可能改善了APP/PS1小鼠脑海马区的病理损伤及Aβ和Tau蛋白表达3.1“补肾健脾,填精益髓”针法能够减轻APP/PS1小鼠脑海马区的病理损伤正常对照组海马区组织完好,神经元细胞体积较大,排列比较整齐,结构清晰,细胞质着色较浅且均匀;与正常对照组相比,APP/PS1小鼠神经元数量较少,体积变小,结构稀疏、不规则,神经元大量坏死和损伤,部分空泡变性;与模型组比较,针刺治疗组海马区的神经元细胞数量增多,而且结构较为紧密,病理改变水平较低,细胞排列紊乱、变性等病理损伤有所减轻。3.2“补肾健脾,填精益髓”针法能够调节APP/PS1小鼠脑海马区Aβ和Tau蛋白的表达WB分析显示,与正常对照组比较,模型组小鼠脑海马组织中Aβ蛋白表达明显增加（P＜0.01）,“补肾健脾,填精益髓”针法治疗可降低Aβ蛋白表达（P＜0.05）。与正常对照组比较,模型组小鼠海马组织中Tau蛋白表达增加（P＜0.05）,针刺后,海马区Tau蛋白表达较模型组降低,虽无显著性差异,但针刺对Tau蛋白的调整与正常对照组具有相同趋势。针刺组对Aβ和Tau蛋白表达的治疗作用与正常对照组相似。4.“补肾健脾,填精益髓”针法可能改善APP/PS1小鼠血清炎症因子水平ELISA分析结果显示,与正常对照组比较,模型组小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10和LPS表达增强,LPS表达具有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较,阳性药对照组和针刺治疗组均能显著降低小鼠血清IL-10（P＜0.01）,阳性药对照组能显著降低小鼠血清LPS（P＜0.01）水平,针刺治疗组能降低小鼠血清LPS（P＜0.05）水平。但各组间IL-1β和TNF-α含量无显著差异。5.“补肾健脾,填精益髓”针法能够改善APP/PS1小鼠肠道菌群多样性及结构组成5.1α多样性Shannon指数显示,与正常对照组相比,模型组小鼠的Shannon指数下降,表明肠道菌群多样性较低,“补肾健脾,填精益髓”针法提高了Shannon指数,增加了肠道菌群多样性趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。Simpson指数显示,与正常对照组相比,模型组小鼠的Simpson指数上升,表明肠道菌群多样性较低,“补肾健脾,填精益髓”针法降低了Simpson指数,增加了肠道菌群多样性趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。5.2β多样性PCA和PCo A分析结果显示:与模型组比较,针刺治疗组PCA和PCo A评分接近正常对照组。5.3正常对照组、模型组与针刺治疗组小鼠肠道菌群的比较三组在门、纲、目、科、属各水平比较后具有显著性差异的菌群有35种,“补肾健脾,填精益髓”针法治疗后,小鼠的肠道菌群在门纲目科属等各水平上的变化显示了回调作用的27种（占77.14%）,其中具有显著性回调作用的有14种（占51.85%）,分别是放线菌门（Actinobacteria）、梭菌纲（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、理研菌科（Rikenellaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、梭菌科（Clostridiaceae1）、普氏菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）、拟普雷沃氏菌属（Alloprevotella）、艾森伯格属（Eisenbergiella）、Alistipes、颤螺菌属（Oscillibacter）;具有回调趋势的有13种（占48.15%）,分别是放线菌纲（Actinobacteria）、红蝽菌目（Coriobacteriales）、蛭弧菌目（Bdellovibrionales）、脱硫弧菌目（Desulfovibrionales）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、蛭弧菌科（Bdellovibrionaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、红蝽菌科（Coriobacteriaceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、吸血弧菌属（Vampirovibrio）、Intestinimonas、厌氧杆菌属（Anaerobacterium）、肠杆菌属（Enterorhabdus）。5.4小鼠肠道菌群代谢功能预测三组间有103条代谢途径发生显著变化,其中有6条代谢通路与代谢组学检测中出现的差异代谢通路一致,分别是:嘧啶代谢（Pyrimidine metabolism）;苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成（Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis）;亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）;D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-Glutamine and D-glutamate metabolism）;牛磺酸和亚牛磺酸代谢（Taurine and hypotaurine metabolism）;苯丙氨酸代谢（Phenylalanine metabolism）。正常对照组和模型组间具有差异（P＜0.05）的代谢通路有95条,模型组和针刺治疗组间具有差异（P＜0.05）的代谢通路有8条,其中同时出现的差异代谢通路是4条,分别是:烟酸和烟酰胺代谢（Nicotinate and nicotinamide metabolism）（P＜0.01）、甲烷代谢（Methane metabolism）（P＜0.01）、脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）（P＜0.01）以及磷酸盐和次磷酸盐代谢（Phosphonate and phosphinate metabolism）（P＜0.01）。其中,针刺增加了烟酸和烟酰胺代谢（P＜0.05）、甲烷代谢（P＜0.05）和脂肪酸生物合成（P＜0.05）3条相关微生物通路表达;降低了磷酸盐和次磷酸盐代谢（P＜0.05）相关微生物通路表达。5.5小鼠肠道菌群与血清炎症因子关联性分析在门水平上,Actinobacteria（放线菌门）与LPS（*P＜0.05）呈正相关。在纲水平上,Actinobacteria（放线菌纲）属于放线菌门与LPS（*P＜0.05）呈正相关,Clostridia（梭菌纲）与LPS（*P＜0.01）和IL-10（*P＜0.05）呈负相关。在目水平上,Clostridiales（梭菌目）与LPS（*P＜0.01）和IL-10（*P＜0.05）呈负相关,Bdellovibrionales（蛭弧菌目）与LPS（*P＜0.05）呈负相关,Coriobacteriales（红蝽菌目）与LPS（*P＜0.05）呈正相关。在科水平,Ruminococcaceae（瘤胃菌科）（*P＜0.05）、Bdellovibrionaceae（蛭弧菌科）（*P＜0.05）、Rikenellaceae（理研菌科）（*P＜0.01）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）（*P＜0.05）、Bacteroidaceae（拟杆菌科）（*P＜0.05）均与LPS呈负相关,其中Rikenellaceae、Lachnospiraceae和Prevotellaceae与IL-10呈负相关（*P＜0.05）;Porphyromonadaceae（紫单胞菌科）、Coriobacteriaceae（红蝽菌科）与LPS呈正相关（*P＜0.05）。在属水平上,Vampirovibrio（吸血弧菌属）（*P＜0.05）、Anaerobacterium（厌氧杆菌属）（*P＜0.05）、Alistipes（*P＜0.01）、Bacteroides（拟杆菌属）（*P＜0.05）与LPS呈负相关,Alistipes（*P＜0.05）、Oscillibacter（颤螺菌属）（*P＜0.01）、Alloprevotella（拟普雷沃氏菌属（*P＜0.01））、Eisenbergiellaa（艾森伯格属）（*P＜0.01）与IL-10呈负相关;Enterorhabdus（肠杆菌属）（*P＜0.01）与LPS呈正相关。以上菌群与LPS和IL-10的关联性,同前一部分炎症因子与菌群相对丰度变化结果一致。可能与促炎相关的菌群有Actinobacteria、Actinobacteria、Coriobacteriales、Porphyromonadaceae、Coriobacteriaceae和Enterorhabdus,共计6种。可能参与抑制LPS和/或IL-10的有Clostridia、Clostridiales、Bdellovibrionales、Ruminococcaceae、Bdellovibrionaceae、Rikenellaceae、Lachnospiraceae、Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Vampirovibrio、Anaerobacterium、Alistipes、Oscillibacter、Alloprevotella、Eisenbergiella、Bacteroides,共计16种。6.“补肾健脾,填精益髓”针法对APP/PS1小鼠粪便代谢物具有影响6.1三组差异代谢物的筛选及鉴定PLS-DA分析显示对照组、模型组和针刺干预组的粪便代谢物谱具有明显聚类,以Vip Score＞1.2对三组代谢物进行筛选及鉴定,共找出对三组间聚类具有重要贡献的代谢物99种,采用ANOVA进行组间差异分析,其中93种代谢物具有差异（P＜0.05）。与正常对照组相比,模型组有62种代谢物表达上调,有37种代谢物表达下调;与模型组相比,针刺治疗组中43种代谢物表达上调,56种代谢物表达下调。6.2三组差异代谢物通路分析将Vip Score＞1.2的99种代谢物数据导入Metabo Analyst 5.0分析工具中,进行KEGG代谢通路分析,结果显示:与针灸调节作用相关的最重要的代谢途径是嘧啶代谢（Pyrimidine metabolism）;丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢（Alanine,aspartate and glutamate metabolism）;精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）;苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成（Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis）;亚油酸代谢（Linoleic acid metabolism）;D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-Glutamine and D-glutamate metabolism）;牛磺酸和亚牛磺酸代谢（Taurine and hypotaurine metabolism）;苯丙氨酸代谢（Phenylalanine metabolism）。上述8条代谢通路中有6条通路与肠道菌群代谢功能预测通路结果一致,仅有丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢和精氨酸生物合成未在肠道菌群的通路中出现。8条差异代谢通路上涉及到12种重要化合物。与正常对照组相比,模型组中Deoxyuridine（脱氧尿苷）、Thymine（胸腺嘧啶）、d TMP（脱氧胸苷酸）、UM（尿苷一磷酸）P、Thymidine（胸苷）、Uracil（尿嘧啶）、N-Acetylaspartic acid（N-乙酰天冬氨酸）、L-Phenylalanine（苯丙氨酸）、Taurine（牛磺酸）、Linoleic acid（亚油酸）等10种代谢物表达上调,L-Aspartic acid（天冬氨酸）和L-Glutamic acid（谷氨酸）的个2种代谢物表达下调;与模型组相比,针刺治疗组上调了L-Aspartic acid和L-Glutamic acid等2种代谢物表达,下调了Deoxyuridine、Thymine、d TMP、UMP、Thymidine、Uracil、N-Acetylaspartic acid、L-Phenylalanine、Taurine、Linoleic acid等10种代谢物表达。从结果可以看出,针刺组调整趋势与正常对照组一致。6.3代谢物与肠道菌群相关性分析与重要代谢通路上化合物相关的菌群一共有25种,其中与嘧啶代谢相关的菌群有21种,与氨基酸代谢相关的菌群有19种,与脂代谢相关的菌群有4种。变形菌门可能与核苷酸代谢关系紧密。Oscillibacter可能与牛磺酸代谢关系密切。Actinobacteria（放线菌门）、Actinobacteria（放线菌纲）、Bacteroidaceae、Bacteroides和Enterorhabdus与苯丙氨酸代谢关系密切。Actinobacteria（放线菌门）、Actinobacteria（放线菌纲）、Verrucomicrobiales、Desulfovibrionales、Desulfovibrionaceae、Porphyromonadaceae、Lachnospiraceae、Enterorhabdus、Oscillibacter、Alloprevotella和Eisenbergiella等11种菌群可能增强核苷酸代谢和氨基酸代谢。结论:1.通过文献研究总结了针灸临床治疗AD的选穴规律,并根据肠脑轴理论形成了“补肾健脾、填精益髓”针法,即选用百会、肾俞、脾俞、足三里、三阴交、肺俞、合谷治疗AD。2.“补肾健脾,填精益髓”针法可能通过影响APP/PS1小鼠脑海马区Aβ、Tau蛋白表达,调节血清IL-1β、IL-10、TNF-α、LPS表达,进而改善APP/PS1小鼠脑海马区的病理变化及小鼠的空间学习和记忆能力。3.“补肾健脾,填精益髓”针法可能通过提高理研菌科、普氏菌属等有益菌丰度,降低放线菌门、紫单胞菌科等有害菌丰度,通过肠脑轴调整肠道稳态、改善肠道炎症,调节免疫功能等发挥治疗AD的作用,这为以肠道菌群为切入点深入研究针灸治疗AD的机理提供了线索。4.“补肾健脾,填精益髓”针法可能通过调节脂类代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢来影响三羧酸循环和尿素循环等,进而改善AD。针灸是一种多方面的整体调理手段,对机体的调节具有整体性。